未折叠蛋白反应在镉诱导大鼠肝细胞BRL3A自噬中的信号调控机制

摘要

目的：本实验室在以往研究中发现镉胁迫除了可以诱导细胞凋亡外，还能诱导细胞自噬；同时镉也能引发内质网应激，然而内质网应激诱导自噬的具体信号通路尚不清楚。本研究旨在探讨未折叠蛋白反应在镉诱导大鼠肝细胞BRL3A自噬中的信号调控机制。
　　方法：本研究主要通过应用噻唑蓝(MTT)法、Hoechst33342法、流式细胞术、免疫印迹实验(Western blot analysis，WB)检测细胞凋亡和细胞自噬。首先确定镉诱导BRL3A细胞自噬的发生与镉作用浓度、时间的关系，明确镉诱导的自噬与细胞存活的关系，接着确定未折叠蛋白反应是否参与了自噬的调控，最后检测未折叠反应信号通路中具体有哪些信号途径参与了其中的调控作用，以明确自噬和细胞存活的关系以及内质网应激相关的自噬调控信号通路在镉诱导的BRL3A细胞毒性中的调节机制
　　结果：在同一作用时间、不同处理浓度的镉胁迫实验中发现：浓度为10μM、20μM的CdCl2作用BRL3A细胞24h可诱导细胞自噬；在同一处理浓度、不同作用时间的镉胁迫实验中发现：镉作用4h、8h、12h均能引起细胞不同程度的自噬，明确了自噬的发生与镉作用浓度、时间的关系；通过WB检测GRP78、PERK、IRE1和ATF6蛋白的表达确定镉诱导的未折叠蛋白反应是否参与了自噬的调控及具体哪条信号通路参与了其中的信号调控，结果发现未折叠蛋白反应中的PERK和IRE1信号通路中参与了其中的信号调控作用。
　　结论：①镉胁迫导致的BRL3A细胞自噬与其作用时间和浓度相关；②未折叠蛋白反应中的PERK和IRE1信号途径参与了镉胁迫导致的细胞自噬反应。

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中英缩略词表

第1章 前言

? 国内外研究现状分析

? 本研究的学术思想

第2章 材料与方法

2.1 实验细胞系

2.2 主要材料与试剂

2.3 实验主要仪器和设备

2.4 主要试剂的配制

2.5 实验方法

2.6 数据处理

第3章 结果

3.1 不同浓度镉处理BRL 3A细胞24 H后形态学观察

3.2 MTT法检测镉作用BRL 3A细胞后的细胞毒性

3.3 MDC检测细胞自噬

3.4Hoechst 3342检测细胞凋亡

3.5 流式细胞术检测细胞凋亡

3.6 Western-blot检测相关蛋白的结果

3.7 形态学观察诱导剂与抑制剂对BRL 3A细胞的影响

3.8 MTT检测诱导剂与抑制剂处理BRL3A细胞后的细胞毒性

3.9 MDC检测诱导剂与抑制剂对BRL3A细胞自噬的影响

3.10 Hoechst3342检测诱导剂与抑制剂对BRL3A细胞凋亡的影响

3.11 Western-blot检测诱导剂与抑制剂对BRL 3A细胞的影响

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 重金属与类金属与自噬关系的研究进展