Atg4B调控Bcl-2与Beclin1的解离在氯化镉诱导A549细胞凋亡与自噬中的机制研究

摘要

镉(Cd)是一种对人体有害的元素，可通过呼吸道或皮肤吸收进入人体，因半衰期长、排泄率低，逐渐累积在人体的各种组织器官中，从而引起多器官损害，甚至促进癌症发展。研究表明，低剂量的镉可以诱导凋亡和自噬。越来越多的研究表明细胞凋亡与自噬之间存在密不可分的关系，如自噬相关蛋白(Atg)12，通过与Bcl-2家族成员相互作用诱导凋亡。同样，抗凋亡蛋白Bcl-2家族也可以调节自噬。Atg4B作为Atg家族中的一员，在自噬发生的过程中具有重要作用。课题组前期研究发现氯化镉(CdCl2)通过诱导活性氧(ROS)产生引起Atg4B表达上调，Atg4B上调诱导的自噬在A549细胞周期和增殖的变化中起了重要作用。目前没有文献报道Atg4B在凋亡中的作用，且低剂量CdCl2诱导凋亡与自噬的转换机制也在探索阶段。因此，本研究以CdCl2作为研究对象，探讨Atg4B在CdCl2所诱导的凋亡与自噬中的作用。
　　目的:探讨Atg4B在CdCl2诱导的A549细胞凋亡和自噬中可能的分子机制。
　　方法:本研究以人肺腺癌细胞（A549细胞）作为实验模型，通过蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测CdCl2对A549细胞凋亡与自噬相关蛋白表达的影响。运用吖啶橙(AO)染色法和Hoechst染色法观察CdCl2对A549细胞酸性自噬泡(AVOs)和细胞核形态的影响。通过AO染色法和Western blot检测凋亡抑制剂Z-VAD-FMK预处理后CdCl2对A549细胞AVOs和自噬相关蛋白表达的影响。使用Western blot和Hoechst染色法检测自噬抑制剂3MA预处理后CdCl2对A549细胞凋亡相关蛋白和细胞核形态的影响。通过JC-1染色法检测3MA预处理后CdCl2对A549细胞中线粒体膜电位(MMP)变化的影响。运用siRNA干扰和质粒转染技术，检测Atg4B对CdCl2引起细胞凋亡的影响。通过Western blot检测线粒体解偶联剂CCCP对Atg4B蛋白表达的影响。使用JC-1染色法检测Atg4B对MMP的影响。运用siRNA干扰和质粒转染技术，检测Bcl-2对CdCl2引起自噬相关蛋白表达的影响，及Bcl-2对Atg4B介导的自噬与凋亡相关蛋白表达的影响。通过蛋白质免疫共沉淀法检测Atg4B、Bcl-2和Beclin1之间相互作用的影响。
　　结果:2μM CdCl2作用于A549细胞12和24小时Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9、胞浆细胞色素C、Atg4B表达升高，Bcl-2表达降低（P＜0.05，P＜0.01）;Hoechst染色法观察到CdCl2处理A549细胞12和24小时，固缩、碎裂的细胞核数量明显增加(P＜0.01)。说明CdCl2在12和24小时诱导A549细胞凋亡。CdCl2处理A549细胞36和48小时，LC3-Ⅱ和Beclin1表达增多，P62表达降低（P＜0.01）;AO染色结果可见，CdCl2处理36和48小时AVOs增多（P＜0.01）。说明此时A549细胞发生自噬。Z-VAD-FMK预处理后CdCl2作用36小时LC3-Ⅱ、Beclin1表达较单独CdCl2处理组降低，P62表达升高(P＜0.05，P＜0.01);AO染色结果可见Z-VAD-FMK预处理后CdCl2处理组AVOs形成较单独CdCl2处理组减少(P＜0.01)。说明CdCl2诱导的凋亡对自噬的发生有调控作用。3MA预处理后CdCl2处理48小时Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9、胞浆细胞色素C表达较单独CdCl2处理组升高(P＜0.05，P＜0.01);Hoechst染色法观察到A549细胞中3MA预处理后CdCl2作用36和48小时，固缩、碎裂的细胞核数量明显增加(P＜0.01)。说明CdCl2诱导的自噬对凋亡有抑制作用。为了明确CdCl2诱导的自噬是否通过稳定MMP来抑制A549细胞凋亡，通过JC-1染色法，观察到3MA预处理后，MMP恢复较单独CdCl2处理组降低(P＜0.01)。说明CdCl2诱导的自噬通过恢复MMP来抑制细胞凋亡。在Atg4BsiRNA处理的A549细胞中，与单独CdCl2处理组相比，Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9表达降低，Bcl-2表达升高（P＜0.05，P＜0.01）;在Atg4B质粒转染的A549细胞中，随着Atg4B表达升高，Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9表达升高，Bcl-2表达降低(P＜005，P＜0.01);TUNEL和Hoechst染色法可见凋亡细胞数和固缩、碎裂的细胞核数量均明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。说明Atg4B可以介导CdCl2诱导的细胞凋亡。CCCP（0.5μM）作用于A549细胞24小时，检测到Atg4B蛋白表达升高(P＜0.01);采用JC-1染色法，分析证实在Atg4B siRNA和Atg4B质粒处理的细胞中，MMP没有明显的改变。说明MMP改变影响Atg4B蛋白的表达，而Atg4B的改变对MMP没有明显的调控作用。在Bcl-2siRNA处理的A549细胞中，与单独CdCl2处理组相比，LC3-Ⅱ、Beclin1表达升高，P62表达降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2过表达诱导LC3-Ⅱ、Beclin1表达降低，P62表达升高(P＜0.05)。说明Bcl-2可以介导CdCl2诱导的细胞自噬。通过Bcl-2和Atg4B质粒共转染技术，证实Atg4B通过Bcl-2介导A549细胞凋亡与自噬。蛋白质免疫共沉淀实验进一步表明，Atg4B通过与Bcl-2结合使Bcl-2和Beclin1解离，从而释放Beclin1，诱导Beclin1依赖性自噬。
　　结论:Atg4B与Bcl-2的结合促进了Bcl-2和Beclin1的解离，这可能是CdCl2诱导A549细胞发生凋亡和自噬的主要机制。

目录

声明

摘要

前言

1．1 实验对象

1．2 主要药物和试剂

1．3 主要仪器

2．实验方法

2．1 细胞培养和处理

2．2 小干扰RNA(siRNA)的转染

2．3 质粒转染

2．4 吖啶橙(AO)染色

2．5 Hoechst染色

2．6 MMP检测

2．7 TUNEL凋亡检测

2．8 蛋白质免疫印迹(Western blot)

2．9 蛋白质免疫共沉淀

3．统计方法

结果

1．CdCl2对A549细胞凋亡与自噬的影响

2．CdCl2诱导的凋亡在A549细胞自噬中的影响

3．CdCl2诱导的自噬在A549细胞凋亡中的影响

4．Atg4B在CdCl2诱导的A549细胞凋亡中的作用

5．Atg4B与MMP的作用关系

6．Bcl-2对CdCl2诱导的A549细胞自噬相关蛋白表达的影响

7．Bcl-2对Atg4B诱导的A549细胞中凋亡和自噬相关蛋白表达的影响

8．CdCl2诱导的Atg4B和Bcl-2的相互作用促进了Bcl-2和Beclin1在A549细胞中的解离

讨论

结论

参考文献

综述 细胞凋亡与自噬关系的研究进展

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢