肠外谷氨酰胺补充对脓毒症大鼠淋巴器官细胞凋亡的影响

摘要

目的：
　　脓毒症仍是危重病的重要死亡原因之一，淋巴细胞凋亡是脓毒症的重要病理生理机制之一，本实验拟研究经肠外途径给予不同剂量的谷氨酰胺对脓毒症大鼠淋巴器官细胞凋亡的影响。
　　方法：
　　1、随机将SD大鼠分成五组：假手术组（SHAM）、模型组（CLP）、低剂量谷氨酰胺组（L-GLN）、中剂量谷氨酰胺组（M-GLN）、高剂量谷氨酰胺组（H-GLN），采用盲肠结扎穿孔对后四组大鼠行脓毒症模型制备，于术后立即分别给予尾静脉注射生理盐水、0.35g/kg谷氨酰胺、0.5g/kg谷氨酰胺、0.75g/kg谷氨酰胺，同时为了排除手术本身产生的影响，对行假手术的大鼠尾静脉注射生理盐水作为假手术组。
　　2、观察记录各组大鼠术后的表现，在各组大鼠造模24小时后于腹腔麻醉下，测量大鼠肛温、呼吸、心率，通过颈总动脉采血、离心，取血清备用检测，同时随机对各组3只大鼠进行颈总动脉采血行血培养，取脾脏、胸腺标本于10％甲醛固定后，包埋切片做免疫组化。
　　3、原位末端标记法（TUNEL）测胸腺、脾脏的细胞凋亡，免疫组化测caspase3、Hsp90在胸腺、脾脏组织中的表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）测大鼠血清IgA、IgG、IgM水平及血清TNF-α、IL-10水平。
　　结果：
　　1、确认脓毒症大鼠动物模型成功建立：腹腔麻醉下监测各组大鼠肛温、呼吸、心率，与假手术组比较，模型组及低、中、高剂量谷氨酰胺组大鼠肛温降低大于1℃，呼吸频率增快2倍以上，心率增加超过50%，符合SIRS动物模型诊断标准，通过解剖腹腔可见：腹腔大量血性带恶臭渗出物，结扎盲肠端发黑、表面见黄色脓液等腹腔感染原发病灶表现，同时，模型组及低、中、高剂量谷氨酰胺组随机抽取的血培养均培养出混合菌的感染证据，据此可认为盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠造模成功。
　　2、各组大鼠脾脏、胸腺细胞凋亡指数结果：假手术组大鼠脾脏、胸腺存在较低的细胞凋亡；模型组大鼠脾脏、胸腺存在明显的细胞凋亡，与假手术组比较具有显著差异（p<0.01）；低、中、高剂量谷氨酰胺组大鼠脾脏、胸腺细胞凋亡较模型组逐渐减少（p<0.05或p<0.01）；高剂量谷氨酰胺组抗细胞凋亡作用优于低剂量谷氨酰胺组（p<0.05）。
　　3、各组大鼠脾脏、胸腺caspase3蛋白的阳性表达结果：假手术组大鼠脾脏、胸腺caspase3蛋白存在较低的阳性表达；模型组与假手术组比较大鼠脾脏、胸腺caspase3蛋白阳性表达积分显著增高（p<0.01）；低、中、高剂量谷氨酰胺组较模型组大鼠脾脏、胸腺caspase3蛋白阳性表达积分逐渐下降（p<0.05或p<0.01）；高剂量谷氨酰胺组大鼠脾脏、胸腺caspase3的阳性表达积分较低剂量谷氨酰胺低（p<0.01）。
　　4、各组大鼠脾脏、胸腺Hsp90蛋白的阳性表达结果：假手术组大鼠脾脏、胸腺Hsp90存在较低的阳性表达；模型组较假手术组大鼠脾脏、胸腺Hsp90蛋白阳性表达积分显著增高（p<0.01）；低、中、高剂量谷氨酰胺组较模型组大鼠脾脏、胸腺Hsp90阳性表达积分逐渐增加（p<0.05或p<0.01）；高剂量谷氨酰胺组大鼠脾脏、胸腺Hsp90的阳性表达积分较低剂量谷氨酰胺组高（p<0.01）。
　　5、各组大鼠血清IgM、IgG、IgA水平：模型组大鼠血清IgA、IgM、IgG水平均较假手术组显著降低（p<0.01），低、中、高剂量谷氨酰胺组大鼠血清IgA、IgM、IgG水平均高于模型组（p<0.01或p<0.05），高剂量谷氨酰胺组大鼠血清IgA、IgM水平高于低剂量谷氨酰胺组（p<0.01或p<0.05）。
　　6、各组大鼠血清TNF-a、IL-10水平：模型组大鼠血清TNF-a、IL-10水平均显著高于假手术组（p<0.01），低、中、高剂量谷氨酰胺组与模型组比较大鼠血清TNF-ɑ水平均显著降低（p<0.01），高剂量谷氨酰胺组较低剂量谷氨酰胺组大鼠血清TNF-ɑ水平更低（p<0.05）。
　　结论：
　　肠外谷氨酰胺补充可抑制脓毒症大鼠淋巴器官细胞凋亡，且抗细胞凋亡作用与谷氨酰胺给药剂量呈正相关性，谷氨酰胺可能是通过诱导Hsp90的表达，抑制caspase-3的活化，发挥抗细胞凋亡作用。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第3章 结果

3.1 各实验大鼠基本情况

3.2 各组大鼠术后体温、呼吸、心率的观察

3.3 各组大鼠血培养结果

3.4 各组大鼠脾脏、胸腺细胞凋亡检测结果

3.5 各组大鼠脾脏、胸腺组织caspase3、Hsp90蛋白表达结果

3.6 各组大鼠血清IgA、IgM、IgG检测结果

3.7 各组大鼠TNF-ɑ、IL-10检测结果

第4章 讨论

4.1 脓毒症大鼠模型的成功建立

4.2 淋巴细胞异常凋亡是脓毒症的重要的病理生理机制之一

4.3 谷氨酰胺与热休克蛋白90的表达

4.4 热休克蛋白90与细胞凋亡

4.5 各组大鼠IgA、IgM、IgG水平的变化及其意义

4.6 各组大鼠促炎与抗炎因子的变化及其分析

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附图

攻读学位期间的研究成果

综述： 谷氨酰胺对脓毒症炎症反应失衡免疫调理作用的研究进展