谷氨酰胺经Hsp90对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的影响

摘要

目的： 脓毒症心肌损伤是脓毒症预后不良的重要原因。心肌细胞的凋亡是脓毒症心肌损伤的重要机制之一。谷氨酰胺（Gln）近来被证实具有心肌细胞保护作用。本研究旨在探讨谷氨酰胺对热休克蛋白90（Hsp90）过表达和基因沉默的脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制。 方法： 72只清洁级雄性Wistar大鼠，随机分为12组：正常对照组（Normal）；脓毒症模型（CLP）组；Hsp90过表达（Adv-Hsp90）组；Hsp90过表达+脓毒症（Adv-Hsp90+CLP）组；Hsp90基因敲除（Adv-Hsp90dsDNA）组；Hsp90基因敲除+脓毒症（Adv-Hsp90dsDNA+CLP）组；谷氨酰胺（Gln）组、谷氨酰胺+脓毒症（Gln+CLP）组；谷氨酰胺+Hsp90过表达（Gln+Adv-Hsp90）组；谷氨酰胺+Hsp90过表达+脓毒症（Gln+Adv-Hsp90+CLP）组；谷氨酰胺+Hsp90基因敲除（Gln+Adv-Hsp90dsDNA）组和谷氨酰胺+Hsp90基因敲除+脓毒症（Gln+Adv-Hsp90dsDNA+CLP）组。每组6只。设计和构建携带Hsp90基因和Hsp90基因敲除的腺病毒，转染大鼠，采用盲肠结扎穿刺法制作脓毒症大鼠模型。术后2小时，经大鼠尾静脉注射0.75g/kg/d谷氨酰胺。48小时后采集心脏组织标本进行检测。采用苏木色精-伊红法（HE）染色法观察大鼠心肌组织的病理变化。应用原位末端转移酶标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡。以实时荧光定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）和免疫印迹法（western blotting）检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Hsp90、p53和PUMA的表达。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠心肌组织caspase-3、 caspase-9和caspase-8的活性。 结果： 与正常对照组相比，CLP组和Adv-Hsp90dsDNA+CLP组大鼠心脏病理损伤严重，且绿色荧光的凋亡细胞明显增多；Gln+Adv-Hsp90+CLP组心脏也有损伤，但程度明显减轻，且绿色荧光凋亡细胞明显减少。与正常对照组相比，CLP组心肌组织Bcl-2蛋白活性降低（p<0.05），Bax蛋白活性增高（p<0.05），p53和PUMA mRNA表达增多（p<0.05）。与CLP组相比，Adv-Hsp90+CLP组、Gln+CLP组、Gln+Adv-Hsp90DNA+CLP组Bcl-2蛋白浓度升高（p<0.05），Bax蛋白浓度降低（p<0.05），p53和PUMA mRNA表达减少（p<0.05）。与CLP组相比，Adv-Hsp90+CLP组、Gln+CLP组、Gln+Adv-Hsp90DNA+CLP组caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性显著降低（ p<0.05）。与 Gln+CLP组相比，Gln+Adv-Hsp90dsDNA+CLP组caspase-3、caspase-8和caspase-9显著升高（p<0.05）结论： 结论： 谷氨酰胺通过诱导热休克蛋白90的表达，降低脓毒症大鼠心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。需要进一步的研究来证实谷氨酰胺是否对脓毒症患者具有同样的治疗作用。

目录

声明

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 实验分组：

2.2.2 重组腺病毒转染大鼠：

2.2.3 动物造模

2.2.4 谷氨酰胺干预

2.2.5 大鼠心脏标本的采集

2.2.6 大鼠心脏病理学观察（HE染色法）

2.2.7 大鼠心肌细胞凋亡检测（TUNEL法）

2.2.8 大鼠心脏组织Bax、Bcl-2、Hsp90、p53、PUMA的RNA的表达（实时荧光定量多聚酶链式反应法QRT-PCR）

2.2.9 大鼠心肌组织 Bcl-2, Bax, Hsp90 蛋白含量检测（免疫印迹法Western blotting）

2.2.10 大鼠心脏组织含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)活性的检测（ELISA法）

2.2.11统计学分析

第3章 结果

3.1心脏组织病理结果

3.2心肌细胞凋亡检测结果

3.3 Hsp90和凋亡相关基因的蛋白及mRNA的表达结果

3.4 caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性检测情况

第4章 讨论

4.1 脓毒症心肌损伤机制

4.2脓毒症动物模型

4.3 热休克蛋白90

4.4 谷氨酰胺

4.5 谷氨酰胺诱导热休克蛋白90表达降低脓毒症大鼠心肌细胞凋亡

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:脓毒症心肌损伤的机制