樟树籽油甘油酯分离纯化及抑菌活性

摘要

樟树（Cinnamomum camphora(L.) Presl）为樟科樟属中经济价值最大的树种之一，主要生长在长江以南地区。樟树籽含油量40％以上，富含C10～C12的中碳链脂肪酸，含量可达90%以上，具有预防和治疗动脉血栓，降血脂和抑菌等作用。利用樟树籽油（CSO）通过酶解法获得中碳链脂肪酸甘油酯（MCFA-GE），具有改善餐后血脂，抑制体重增加及抑菌作用。樟树籽取材方便，资源量巨大，目前多以废弃垃圾形式处理掉，利用率小，造成巨大的资源浪费。为此对樟树籽的中MCFA-GE进行系统性的研究尤为重要。
　　本文以樟树籽为实验材料采用物理压榨法，脱臭脱色制得精炼CSO。通过Lipozyme RM IM固定化脂肪酶获得樟树籽油甘油酯（CS-GE），采用柱层析法进一步分离得到樟树籽油甘油三酯（CS-TAG）、樟树籽油甘油二酯（CS-DAG）和樟树籽油单甘酯（CS-MG）。为了进一步开发CS-TAG、CS-DAG和CS-MG的功能活性，通过滤纸片法，最小抑菌浓度（MIC），抑菌活力测定的研究CS-TAG、CS-DAG、CS-MG对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌的抑菌活性。通过对菌液电导率、可溶性蛋白质和核酸含量的测定，探讨了其抑菌机理。论文还研究了异樟、油樟、芳樟、龙脑樟，脑樟5种化学型樟树叶精油的化学组成和抑菌活性。
　　(1)对CSO酶解后的MCFA-GE进行TLC分析，CS-GE的各组分以迁移值CS-TAG（0.94）、CS-FFA（0.83）、CS-1,3-DAG（0.53）、CS-1,2-DAG（0.50），CS-MG（0.07）进行展开。进一步采用柱层析分离MCFA-GE，再对其进行TLC分析，可得到纯度92.7%、98.2%和97.8%的CS-TAG、CS-DAG、CS-MG。采用RP-HPLC-ELSD进一步进行定量分析，结果表明各组分纯度分别为95.1%、92.4和94.6%。
　　(2)以柱层析分离得到的CS-TAG、CS-DAG和CS-MG为实验材料，采用滤纸片法观察抑菌敏感性，96孔平板法测定MIC，抑菌活力实验测定抑菌时效。结果表明，CS-TAG、CS-DAG和CS-MG对4种受试菌均有抑菌效果。CS-TAG、CS-DAG对4种受试菌的抑菌圈直径可达15.03mm～17.76mm为高度敏感，CS-MG对于受试菌的抑菌圈直径可达22.21mm～25.37mm为极度敏感。通过96孔板法和抑菌活力实验，测得CS-TAG、CS-DAG和CS-MG对G+的MIC均小于 G-，对于4种受试菌的抑菌活力均在0.60以上，作用于同种细菌抑菌能力CS-TAG＜CS-DAG＜CS-MG。
　　3、通过CS-TAG、CS-DAG、CS-MG对于4种细菌电导率的测定，分光光度法测定菌液可溶性蛋白质、核酸的含量，扫描电镜观察细菌表面形态。电导率结果表明，CS-TAG、CS-DAG和CS-MG作用于4种受试菌，3～15h时，菌液电导率快速上升，18～24h菌液电导率上升减缓，直至48h趋于平衡。可溶性蛋白质、菌体核酸含量的测定结果表明，加入CS-TAG、CS-DAG和CS-MG的菌液中的蛋白质、核酸量均增加，CS-MG增加最多，CS-TAG最少。对细菌进行扫描电镜形态观察，加入CS-TAG、CS-DAG和CS-MG的细菌的形态发生改变，菌体发生变形或裂解。因此，CS-TAG、CS-DAG和CS-MG可能通过改变细菌的细胞膜通透性，导致受试菌细胞内蛋白质、核酸的泄露，从而达到抑菌作用。
　　4、运用同时蒸馏萃取法获得樟树叶精油，GC-MS分析5种化学型樟树精油化学组成。从异樟，油樟，芳樟，龙脑樟和脑樟叶精油共鉴定出71种已知化合物，脑樟中主要成分为(R)-樟脑（41.02%）、异樟中为反式橙花叔醇（22.52%）、油樟中桉叶脑（41.95%）、芳樟中β-芳樟醇（51.23%）、龙脑樟中龙脑（40.67%）。71种已知化合物中有5类化合物（醇类、酮类、醚类、烯类，这4类物质氧化物和衍生物）除异樟34.93%，脑樟、芳樟、油樟，龙脑樟中5类化合物含量均在81%以上，这5类化合物的总量依次是龙脑樟>油樟>脑樟>芳樟>>异樟。滤纸片法发现樟树叶精油随着浓度的提高，抑菌活性逐渐增大。芳樟、脑樟、油樟、异樟叶精油对G+的抑菌效果总体要比对G-抑菌效果好，其中油樟叶精油抑菌效果最好。
　　通过以上研究表明，柱层析对MCFA-GE的分离效果良好，且各组分纯度高。分离得到的CS-TAG、CS-DAG和CS-MG对4种细菌均有抑菌活性，且对G+的抑菌能力强于G-，对于同种细菌抑菌能力CS-TAG＜CS-DAG＜CS-MG。CS-TAG、CS-DAG和CS-MG可能是通过改变细菌的细胞膜通透性，从而使细菌细胞内蛋白、核酸的泄露，从而达到抑菌作用。本文还对5种樟树叶精油的化学组成和抑菌活性的研究，表明樟树叶精油的抑菌活性可能与其化学组成有一定的关联。

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第一章 绪论

1.1 樟树及其研究现状

1.2 中碳链甘油三酯研究概述

1.3 甘油二酯研究概况

1.4 单甘酯研究概述

1.5 抑菌机理的研究

1.6 研究内容、方法及意义

第二章 樟树籽油甘油酯的分离纯化

2.1 材料与仪器

2.2 方法

2.3 结果分析与讨论

3.4 本章小结

第三章 樟树籽油甘油酯的抑菌活性研究

3.1 材料与仪器

3.2 方法

3.3 结果分析与讨论

4.3 本章小结

第四章 樟树籽油甘油酯的抑菌机理研究

4.1 材料与仪器

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.3 本章小结

第五章 不同化学型樟树叶精油的化学组成及抑菌活性

5.1 材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 结果分析与讨论

5.4 本章小结

第六章 结论与展望

致谢

参考文献