椭圆食粉螨Hsp70基因的克隆及其在热胁迫下的表达研究

摘要

椭圆食粉螨隶属粉螨科，是常见的储粮害螨，对人类经济及健康产生严重危害。椭圆食粉螨的种群动态受到温度的影响很大，超过适宜的温度范围就会造成热胁迫，热胁迫则会诱导其体内热激蛋白的表达来应对逆境。本文以椭圆食粉螨为材料，通过RT-PCR以及RACE技术克隆得到了椭圆食粉螨2个Hsp70基因cDNA的全长，并对其生物信息学进行分析，通过荧光定量PCR（RT-qPCR）技术探究Hsp70 mRNA在不同螨态及热胁迫下的表达水平，主要研究结论如下：
　　1、克隆得到了椭圆食粉螨2条 Hsp70的全长分别命名为：AoHsp70-1和AoHsp70-2，其中AoHsp70-1基因GenBank登录号为KX237517，cDNA的全长为2307 bp，其中开放阅读框（ORF）为1974 bp，编码657个氨基酸残基，蛋白质分子质量为71.92 KDa，等电点pI为5.27，其氨基酸序列包含3个Hsp70家族的签名序列，C-端存在GGXP4肽重复序列，C-端末端存在胞质标志性基序EEVD，；AoHsp70-2基因GenBank登录号为KX237518，cDNA的全长为2623 bp，其中ORF为1923 bp，编码640个氨基酸残基，蛋白质分子质量为70.64 KDa，等电点pI为5.56，其氨基酸序列包含3个Hsp70家族的签名序列， C-端末端存在胞质标志性基序EEVD，AoHsp70-1和AoHsp70-2它们的氨基酸序列都缺失信号肽切割位点，氨基酸序列中都含有6个N-糖基化位点，氨基酸序列都存在多处疏水区，预测的蛋白质三级结构包含N-端结构域（NBD）和底物结合域（SBD）两个结构域。多重序列比对的结果显示 Hsp70具有高度的同源性，不同物种间氨基酸相似性在60％以上，通过 NJ法构建系统树，结果显示 AoHsp70-1和AoHsp70-2先聚为一支，然后再与其他螨类的Hsp70聚为一个大分支，其他所有昆虫的Hsp70聚为一个大分支。
　　2、椭圆食粉螨在不同发育阶段（卵、幼螨、若螨及雌成螨）下其Hsp70的表达水平不尽相同，其中 AoHsp70-1在雌成螨中表达水平略高于其他螨态，但是也没有显著性差异，而 AoHsp70-2在若螨中表达水平最高，是对照组的5.01倍。低温胁迫下AoHsp70-1的表达水平没有显著差异，而 AoHsp70-2的表达水平随着温度的降低而明显升高，并且在5℃时达到最大值为对照组的9.62倍，随着温度的进一步降低 AoHsp70-2表达水平开始下降。高温胁迫下 AoHsp70-1在不同温度下的表达水平没有显著性差异，而 AoHsp70-2的表达水平随着温度的升高而明显升高，并且在39℃时达到最大值为对照组的23.97倍，随着温度的进一步降低其表达水平开始下降。AoHsp70-1和AoHsp70-2对热胁迫响应的不同说明：AoHsp70-1和AoHsp70-2分别是组成型和诱导型的Hsp70，说明诱导型的AoHsp70-2在椭圆食粉螨抗热胁迫中起到了关键性的作用，其在高温胁迫时比低温胁迫有更高的表达量，说明椭圆食粉螨可能对高温更加敏感。

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第1章 前言

1.1 椭圆食粉螨研究概述

1.2 温度对螨的影响

1.3 昆虫热激蛋白研究概述

1.4 本研究的目的意义

1.5 本实验的研究内容

第2章 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

第3章 结果与分析

3.1椭圆食粉螨Hsp70 cDNA全长的克隆

3.2 AoHsp70-1和AoHsp70-2基因全长的生物信息学分析

3.3 不同发育阶段及热胁迫下AoHsp70基因的表达

第4章 讨论

4.1 椭圆食粉螨Hsp70基因分析

4.2 热胁迫下椭圆食粉螨Hsp70基因的表达

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间科研成果及所获荣誉