橙色红曲菌AS3.4384及其基因缺失株的发酵以及几种代谢产物的分析

摘要

红曲是我国的一种传统发酵食品，不仅具有食用价值，还具有药用功效，主要是因为红曲中含有多种具有生理活性的物质，如Monacolin K，黄色素，红色素、橙色素、γ-氨基丁酸等，使其具有降血压、降血脂、抗菌、抗氧化和抗癌等作用。但由于桔霉素的存在，使得红曲菌的广泛应用受到极大限制。研究发现，通过基因工程手段敲除与产桔霉素相关的基因或改变培养基的成分，可以降低红曲菌产桔霉素的能力。因此，本论文考察了橙色红曲菌（M.aurantiacus）pksCT基因缺失株 PHDS26（简称红曲菌 PHDS26）固态发酵获得的红曲米中的Monacolin K，并采用响应面优化了红曲米中的Monacolin K的提取方法，也考察了M.aurantiacus AS3.4384及其基因缺失株在液态发酵条件下所产的次级代谢产物的变化。主要研究结果如下：
　　（1）采用HPLC检测红曲菌PHDS26发酵的红曲米中的Monacolin K，并对流动相进行优化，当乙腈：水=52:48(V/V)时，可以使Monacolin K与Monascin分离；当乙腈：水=75:25(V/V)时，可快速地检测功能性红曲米中的Monacolin K。采用超声法对功能性红曲米中的Monacolin K进行提取，并用响应面方法确定了 Monacolin K的最佳提取工艺，即乙醇浓度67％，提取时间65 min，温度43℃，料液比1:16。
　　（2）采用响应面优化方案得出红曲菌PHDS26液态发酵高产红色素低产桔霉素的最佳培养基，即4.1%大米粉，0.64% NaNO3，0.05% KH2PO4，0.05% K2HPO4，0.1% MgSO4.7H2O；在此基础上，优化红曲菌PHDS26的发酵条件，得出其最优的培养条件，即发酵时间7 d，菌龄48 h，温度30℃，装液量40 mL，初始pH6.2，接种量5%。用上述优化好的条件发酵红曲菌PHDS26，红色素产量高达255.25 U/g，比优化前提高了3倍，桔霉素的产量则为0.125μg/mL，仅为优化前的34.7%。
　　（3）采用优化好的培养基和培养条件分别发酵原始菌株 M.aurantiacus AS3.4384、红曲菌PHDS26、和橙色红曲菌ctnG3基因缺失株（简称红曲菌ctnG3）。M.aurantiacusAS3.4384所产的红色素产量仅有17.125 U/g，桔霉素却高达8.494μg/mL，与之相比，红曲菌PHDS26所产的红色素产量提高了6倍，桔霉素含量减少了98.5%，且所产生的次级代谢产物明显增加，如分子量为425.3的未知物质(51.091 min)、Monasfluore A(56.025 min)、Monasfluore B(64.237 min)、Monascin(59.761 min)、Ankaflavin(68.424 min)、Rubropunctatin(60.205 min)和Monascorubrin(69.689 min)；红曲菌ctnG3所产的黄色素产量升高了2.8倍，为88.91 U/g，红色素仅增加了28%，桔霉素则降低了23.6%。
　　（4）在不同碳源或氮源发酵培养基中，红曲菌PHDS26所产的次级代谢产物经UPLC-QToF-MS分离验证，产量上有明显的差别，用葡萄糖做碳源时，产物明显减少，尤其是Monasfluore A(11.578 min)和 Monasfluore B(13.470 min)，用蛋白胨做氮源时，产物明显增加，但Monascin(12.401 min)及Ankaflavin(14.154 min)的产量却减少了。
　　（5）无机盐离子对红曲菌次级代谢产物的合成有重要影响，尤其是对桔霉素的影响。在原始菌株M.aurantiacus AS3.4384发酵过程中，无机离子刺激桔霉素合成的能力依次为Mg2+>Fe2+>Mn2+>Ca2+，菌株在含有Zn2+的培养基中不生长；在红曲菌 PHDS26发酵过程中，无机离子刺激桔霉素合成的能力依次为Fe2+>Zn2+>Ca2+>Mn2+>Mg2+；在红曲菌ctnG3发酵过程中，无机离子对促进桔霉素合成的影响力依次为Fe2+>Ca2+>Mg2+>Mn2+，菌株在含有Zn2+的培养基中不生长。

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第1章 引言

1.1 红曲菌简介

1.2 红曲菌的主要次级代谢产物

1.3 红曲色素及桔霉素的合成途径

1.4 红曲色素发酵工艺

1.5 本课题研究内容及意义

第2章红曲米中Monacolin K提取条件的优化

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3讨论

2.4 本章小结

第3章 红曲菌 PHDS26 液态发酵培养基及其培养条件的优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 红曲菌AS3.4384及其基因缺失株液态发酵代谢产物的分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

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参考文献