麦冬主要活性成分对OATP1B1、OATP1B3转运功能的影响及其机制研究

摘要

背景：
　　麦冬是参麦注射液主要组分之一，参麦注射液临床上常用于心脑血管疾病，在与心脑血管常用化药合用时可能发生相互作用。我们前期研究发现，作为麦冬的主要活性成分之一的麦冬皂苷 D，是 OATP1B1的底物，OATP1B1抑制剂瑞舒伐他汀和利福平能竞争性抑制OATP1B1对麦冬皂苷D的摄取，而在大鼠原代肝细胞中麦冬皂苷 D在低浓度时能使瑞舒伐他汀的摄取量增加，在高浓度时使瑞舒伐他汀的摄取降低。因此，有必要在此基础上对进一步研究麦冬中主要活性成分包括甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D′等对OATP1B1及OATP1B3活性的影响及其机制，为中药麦冬及其有效成分的临床应用提供理论与实验依据。
　　目的：
　　采用稳定表达OATP1B1、OATP1B3的HEK293T细胞模型，研究麦冬中四种主要活性成分包括甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬皂苷 D和麦冬皂苷 D′，对 OATP1B1和 OATP1B3转运活性的影响及其与OATP1B1和 OATP1B3的关联性，为中药麦冬及其有效成分的临床应用提供理论与实验依据。
　　方法：
　　1.采用 LC-MS或 LC-MS/MS方法对 HEK293T细胞样品中 RSV、ATV、TMST、MA、MB、OPD和OPD′进行定量分析。
　　2.分别考察系列摄取时间和药物浓度对RSV和ATV在OATP1B1-HEK293T细胞中以及对RSV和TMST在OATP1B3-HEK293T细胞中摄取的影响，获得各自底物分别在OATP1B1-HEK293T和OATP1B3-HEK293T细胞中的最佳摄取条件，并以此获得的底物的最佳摄取条件进行后续的相互作用实验。
　　3.将 OATP1B1底物 RSV或 ATV与 MA、MB、OPD或 OPD′同时加于OATP1B1-HEK293T细胞中，分别考察系列浓度的麦冬主要活性成分的作用下RSV或ATV在OATP1B1-HEK293T的转运量，并与空白对照相比较计算其各自的EC50或IC50。
　　4.将 OATP1B3底物 RSV或 TMST与 MA、MB、OPD或 OPD′同时加于OATP1B3-HEK293T细胞中，分别考察系列浓度的麦冬主要活性成分的作用下RSV或TMST在OATP1B3-HEK293T的转运量，并与空白对照相比较计算其各自的EC50或IC50。
　　5.研究麦冬四活性成分在OATP1B1-HEK293T和OATP1B3-HEK293T细胞中的转运情况，进一步探索MA、MB、OPD或OPD′与OATP1B1和OATP1B3的关联性。
　　结果：
　　1.建立的 RSV、 ATV和 TMST以及 MA、MB、OPD和 OPD′的 LC-MS或 LC-MS/MS的定量方法特异性、精密度和精密度均良好，满足生物样品定量分析的相关要求。
　　2. RSV在OATP1B1-HEK293T细胞的摄取在20min趋于饱和，算得其动力学参数Km（μM）与Vmax（pmol/mg protein·min-1）分别为23.73，14.28。ATV在 OATP1B1-HEK293T细胞的摄取在10min趋于饱和，同样求得 OATP1B1-HEK293T细胞摄取ATV的动力学参数Km（μM）与Vmax（pmol/mg protein·min-1）分别为15.78，132.5。因此，在后续的相互作用部分，RSV和ATV作为OATP1B1的底物，二者浓度分别设置为25μM和10μM，摄取时间分别为20min和10min。
　　3. RSV在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取在20min趋于饱和，算得其动力学参数Km（μM）与Vmax（pmol/mg protein·min-1）分别为28.10，9.384。TMST在 OATP1B3-HEK293T细胞的摄取在10min趋于饱和，同样求得 OATP1B3-HEK293T细胞摄取TMST的动力学参数Km(μM)与Vmax(pmol/mg protein·min-1)分别为6.406，39.80。因此，在后续的相互作用部分，RSV和TMST作为OATP1B3的底物，二者浓度分别设置为25μM和5μM，摄取时间分别为20min和10min。
　　4. MA和OPD′对OATP1B1-HEK293T细胞中RSV的摄取有不同程度的促进作用，由Graphpad Prisms求算其EC50分别为3.353μM和3.863μM，而MB和OPD则对RSV在OATP1B1-HEK293T细胞的摄取无明显影响；MA、MB、OPD和OPD′对OATP1B1-HEK293T细胞中ATV的摄取都有不同程度的促进作用，求算其EC50分别为4.470μM、15.52μM、11.34μM和1.25μM。
　　5. MA、MB和OPD对OATP1B3-HEK293T细胞中RSV和TMST的摄取均无明显影响，OPD′对RSV在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取有着一定的促进作用，求算其其EC50为16.63μM；OPD′对TMST在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取却有着显著的抑制作用，由Graphpad Prisms求算其IC50为3.291Μm。
　　6. MA、OPD和OPD′可能是OATP1B1潜在的底物，用Graphpad Prisms求算其Km（μM）分别为26.09，22.99，22.89，Vmax（pmol/mg protein·min-1）分别139.2，12.28，187.8；OPD和OPD′可能是OATP1B3潜在的底物，用Graphpad Prisms求算其Km（μM）分别为17.37和11.27，Vmax（pmol/mg protein·min-1）分别为6.583和146.5。
　　结论：
　　1. MA和OPD′对OATP1B1-HEK293T细胞中RSV的摄取有不同程度的促进作用，MA、MB、OPD和OPD′对OATP1B1-HEK293T细胞中ATV的摄取有不同程度的促进作用。MA、MB、OPD和OPD′对OATP1B1转运活性的影响具有底物选择性。
　　2. MA、MB和OPD对OATP1B3-HEK293T细胞中RSV和TMST的摄取无明显影响，OPD′对RSV在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取有着一定的促进作用，但对TMST在OATP1B3-HEK293T细胞的摄取有着明显的抑制作用，由此可见， OPD′对OATP1B3转运活性的影响具有底物选择性。
　　3. MA可能是 OATP1B1潜在的底物，OPD和 OPD′可能是 OATP1B1和OATP1B3共有的底物， OATP1B1和OATP1B3不介导MB的摄取。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 麦冬主要活性成分对OATP1B1转运功能影响及其机制研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 麦冬主要活性成分对OATP1B3转运功能影响及其机制研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 调控有机阴离子转运多肽转运功能相关机制的研究进展