mTOR信号通路在糖尿病肾病大鼠足细胞损伤中的研究

摘要

目的：
　　通过阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin mTOR）信号通路对糖尿病肾病（diabetic nephropathy DN）大鼠足细胞Ezrin、α-SMA蛋白及外周血Th17/Treg细胞的研究，探讨mTOR通路对DN足细胞骨架蛋白和肌动蛋白合成的影响及Th17/Treg是否通过mTOR信号通路调控足细胞相关蛋白，为DN的治疗提供新的靶点。
　　方法：
　　（1）模型的建立、分组：40只SD雄性大鼠，适应性喂养1周，随机分为2组：正常组（ A组)10只，模型组30只；模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin STZ），剂量为55mg/Kg，3天后用血糖仪测血糖，以随机血糖值≥16.7mmol/L且稳定5天为DN造模成功；若未达标，另追加50mg/kg STZ，并在追加后3天后复测血糖。成功模型组随机分为DN组（B组）、DN+他克莫司（tacrolimus FK506）干预组（C组）、DN+ku0063794干预组(D组)各10只；C、D组每天分别予FK5061mg/kg/d、ku00637941mg/kg/d灌胃，A组、B组分别予以等量生理盐水灌胃。实验0周、4周、8周分别检测A、B、C、D四组大鼠体重、血糖、血肌酐、尿肌酐、24小时尿蛋白定量，ELISA检测各组大鼠外周血IL-17、TGF-β1因子，流式细胞学检测CD4+CD25highTreg细胞占CD4+T百分比率；4、8周时处死各组一半大鼠取肾组织利用RT-PCR检测Ezrin-mRNA、α-SMA-mRNA及Western blotting检测mTOR、Raptor、Rictor、Ezrin、α-SMA蛋白。
　　结果：
　　(1)生化指标①24h尿蛋白定量，组间比较：0周时，B组、C组、D组较A组明显升高（P<0.01），B组、C组、D组间无统计学差异；4周时，B组、C组、D组较 A组明显升高（ P<0.01）， C组、D组低于 B组（ P<0.05)，D组与C组无统计学差异；8周时，B组明显高于A组（P<0.001）， C组、D组明显低于B组（P<0.001），A组、C组、D组无统计学差异。组内比较：B组8周明显高于0周（P<0.05）；C组、D组8周明显低于0周（P<0.05）。②Ccr，组间比较：4周时，B组较A组下降（P<0.05），D组高于B组（P<0.05），C组与B组、D组无统计学差异；8周时，B组较A组明显下降（P<0.05），C组、D组明显高于B组（P<0.05），D组与C组无统计学差异。组内比较无统计学差异。
　　(2)Western blotting指标：①mTOR蛋白，组间比较：4周时，B组、C组、D组较A组升高（P<0.05），C组低于B组（P<0.05），D组与B组、C组无统计学差异；8周时，B组较A组明显升高（P<0.05），C组、D组明显低于B组（P<0.001），A组、C组、D组无统计学差异。组内比较无统计学差异。②Raptor蛋白，组间比较：4周、8周时，B组、C组、D组较A组升高（P<0.05）， C组、D组明显低于B组（P<0.05），D组与C组无统计学差异。组内比较：C组8周低于4周（P<0.05）。③Rictor蛋白，组间比较：4周时，B组、C组、D组较A组升高（P<0.05），C组、D组较B组明显降低（P<0.05），D组与C组无统计学差异差异；8周时，B组较A组明显升高（P<0.001），C组、D组明显低于B组（P<0.001），A组、C组、D组间无统计学差异。组内比较无统计学差异。④Ezrin蛋白，组间比较：4周时，B组、C组、D组较A组降低（P<0.05）， C组、D组高于B组（P<0.05），D组与C组无统计学差异；8周时，B组较A组明显降低（P<0.05），C组、D组明显高于B组（P<0.05），A组、C组、D组间无统计学差异。组间比较：B组8周低于4周（P<0.05）。⑤α-SMA蛋白，组间比较：4周时，B组、C组、D组较A组升高（P<0.05），C组、D组低于B组（P<0.05），D组与C组无统计差异；8周时，B组、C组、D组较A组升高（P<0.05），C组、D组明显低于B组（P<0.05），D组低于C组（P<0.05）。组内比较：B组8周高于4周（P<0.05）；C组、D组8周均低于4周（P<0.05）。
　　（3）RT-PCR指标：①Ezrin-mRNA，组间比较：4、8周时，B组、C组、D组较A组降低（P<0.05），C组、D组高于B组P<0.05），C组与D组无统计学差异（P>0.05）。组内比较无统计学差异。②α-SMA-mRNA，组间比较：4周时，B组、C组、D组较A组升高（P<0.05）， C组、D组明显低于B组（P<0.001）， D组与C组无统计学差异；8周时，B组、C组较A组升高（P<0.05），C组、D组明显低于B组（P<0.001），D组与A组、C组无统计学差异。组内比较无统计学差异。
　　（4）流式细胞学指标：CD4+CD25high Treg百分比，组间比较：4周、8周时，B组较A组明显降低(P<0.05)，C、D高于B组（P<0.05），A组、C组、D组间无统计学差异。组内比较：B组8周、4周较0周明显降低（P<0.001）；D组4周高于8周（P<0.05)。
　　（5）ELISA指标：①TGF-β1，组间比较：4周时，B组、D组较A组升高（P<0.05），D组低于B组（P<0.05），C组与A组、B组、D组无统计学差异；8周时，B组较A组明显升高（P<0.05），C组、D组均与A组、B组无统计学差异，D组高于C组（P<0.001）。组内比较：B组、C组、D组4周、8周均高于0周（P<0.05），D组8周高于4周（P<0.05）。②IL-17，组间比较：4周时，B组、C组较A组升高（P<0.05）， C组、D组低于B组（P<0.05），D组与A组、C组无统计学差异；8周时，B组、C组较A组升高（P<0.05），C组与B组无统计学差异，D组与A组、B组、C组无统计学差异。组内比较：A组8周高于0周（P<0.05）；B组、C组、D组4周、8周明显高于0周（P<0.05）。（6）相关性分析：①B组大鼠4周时，Rictor与与α-SMA-mRNA呈正相关，与Ezrin、Ezrin-mRNA呈负相关；8周时，Rictor与α-SMA、TGF-β1、IL-17呈正相关，与Ezrin、CD4+CD25high Treg呈负相关；Raptor与 Ezrin、Ezrin-mRNA、α-SMA、α-SMA-mRNA、CD4+CD25high Treg、TGF-β1、IL-17无相关。②B组大鼠4周、8周时，CD4+CD25high Treg与TGF-β1蛋白呈均负相关。③B组大鼠4周、8周 Ezrin-mRNA与 CD4+CD25high Treg均呈正相关；8周时， Ezrin、Ezrin-mRNA与TGF-β1、IL-17负相关；④B组大鼠4周时，α-SMA-mRNA与IL-17呈正相关，与CD4+CD25high Treg负相关。
　　结论：
　　1、阻断mTOR通路DN大鼠肾脏能升高肾小球滤过率、降低尿蛋白、改善大鼠精神状态。
　　2、mTORC2信号通路参与了DN的足细胞的Ezrin、α-SMA蛋白的表达。
　　3、Treg可能通过mTORC2信号通路调控Ezrin、α-SMA蛋白的合成。
　　4、 FK506也可同时阻断mTORC1、mTORC2信号通路。