miR-21靶向调控Jagged-1在心肌纤维化中的作用

摘要

目的：
　　基于Notch信号通路筛选出可能调控心肌纤维化的miRNA，从中选出调控作用最显著的miRNA（本研究筛选出miR-21/miRNA-21）。并进一步研究miR-21通过靶向调控Notch信号通路的配体蛋白Jag1(Jagged-1)在心肌纤维化中的作用。
　　方法：
　　1、分离大鼠心肌成纤维细胞(Cardiacfibroblast,CFB)，原代培养，传代培养至细胞最佳状态。实验分为三组：未加TGF-β1(Transforminggrowthfactor-β1)组、10ng/mlTGF-β1组、10ng/mlTGF-β1+10μMDAPT组。经RNA抽提、反转录与qPCR，筛选调控心肌纤维化新型miRNA（假定为miRNA-X）。
　　2、在TGF-β1刺激前，转染miRNA-X的抑制剂，通过WB(WesternBlot)检测TGF-β1刺激下的Vimentin和α-SMA(α-smoothmuscleactin)的表达情况，明确在TGF-β1刺激下，miRNA-X对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(Cardiacfibroblast-myofibroblasttransformation,CMT)的影响作用。
　　3、转染miRNA-X的抑制剂，阴性对照为无义的抑制剂，利用CCK8(cellcountingkit)试剂盒检测miRNA-X对心肌成纤维细胞增殖能力的影响，进一步筛选出调控心肌纤维化效果最显著的miRNA。
　　4、构建psiCHECK-2-Jag13’-UTRWT(Wild-Type)/Muta(Mutation)，将pre-miR-21、对照质粒分别与psiCHECK-2-Jag13’-UTRWT、psiCHECK-2-Jag13’-UTRMuta共转染293T细胞，裂解细胞，检测荧光素酶的荧光强度，分析miR-21与Jag1的3’-UTR的相互关系。
　　5、构建腺病毒Ad-GFP(Adenovirus-GreenFluorescentProtein)以及Ad-miR-21-sponge(Adenovirus-miR-21-sponge)，分离大鼠心肌成纤维细胞，原代培养，传代至细胞生长稳定，分为两组，分别转染Ad-GFP以及Ad-miR-21-sponge，36h后以TGF-β1处理，提取蛋白，WB检测Vimentin、DDR2、a-SMA、Tensin的表达情况。利用CCK8试剂盒检测miR-21对心肌成纤维细胞增殖能力的影响，Transwell侵袭实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力。WB检测Jag1蛋白表达。
　　结果：
　　TGF-β1刺激CFB细胞中，miR-21、miR-23b、miR-140表达量影响比较明显，其中miR-21可与Jag1的3’-UTR结合。阻断miR-21，可显著抑制心肌成纤维细胞的增殖能力，并可抑制其迁移能力，逆转TGF-β1刺激下心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。
　　结论：
　　miR-21通过靶向调控Notch信号通路的配体蛋白Jag1，抑制心肌成纤维细胞的增殖、迁移及心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，发挥抗心肌纤维化作用。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞及菌株CFB细胞

2.1.2 腺病毒载体系统psiCHECK-2载体

2.1.3 主要试剂DMEM培养基

2.1.4 主要仪器CO2细胞培养箱

2.2 实验方法

2.2.1 原代大鼠心肌成纤维细胞的分离

2.2.2 RNA抽提、反转录与qPCR

2.2.3 引物设计

2.2.4 CCK8检测细胞活性

2.2.5 病毒载体构建

2.2.6 Luciferase验证实验

2.2.7 Transwell侵袭实验

2.2.8 Western Blot

2.2.9 统计学分析

第3章 结果

3.1 筛选调控心肌纤维化新型miRNA

3.2 差异miRNA对于CMT的影响

3.3 差异miRNA对心肌成纤维细胞增殖能力的影响

3.4 miR-21靶点Jag1外源性Luciferase验证实验

3.5 miR-21对于Jag1表达量的影响

3.6 miR-21对于CMT的影响

3.7 miR-21对心肌成纤维细胞增殖能力的影响

3.8 miR-21对于CFB细胞迁移能力的影响

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

综述:miRNA与心肌纤维化的研究进展