多奈哌齐延缓MNU诱导的小鼠感光细胞凋亡及其机制的研究

摘要

目的：本研究旨在研究多奈哌齐在视网膜中对MNU诱导的感光细胞凋亡抑制作用的机制。
　　方法：雄性C57BL/6小鼠腹腔注射MNU(60mg/kg)，分别在第1天，第3天，第5天，第7天处死，取眼球进行HE染色观察视网膜各层形态。小鼠玻璃体腔注射热休克蛋白抑制剂Ⅰ，灌胃给予多奈哌齐10mg/kg预处理3天后处死，取眼球做免疫荧光检测，免疫荧光观察Hsp70的表达与定位情况。对小鼠分别灌胃给予不同剂量的多奈哌齐（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）预处理3天后处死小鼠，取眼球进行蛋白印迹检测。对小鼠在不同时间点（1天，3天，5天）灌胃给予较高剂量多奈哌齐（10mg/kg）处死小鼠取眼球进行蛋白印迹检测，观察多奈哌齐诱导Hsp70表达的剂量和时间依赖性。另外小鼠玻璃体腔注射热休克蛋白抑制剂Ⅰ及灌胃给予Bcl-2抑制剂，利用蛋白印迹技术检测Hsp70,Bcl-2的表达情况，同时利用流式细胞术检测感光细胞凋亡的情况。
　　结果：1、HE染色发现腹腔注射MNU后视网膜外核层显著变薄，高峰在第3天，第7天变得更薄，外丛状层在第1，3，5，7天后开始逐渐变薄，然而内核层在第5，7天后才开始变薄，神经节细胞层在各个时间段都没有显著变化。
　　2、免疫荧光检测发现对照组Hsp70在感光细胞内节和外核层有微弱的表达，当给予多奈哌齐预处理3天后，Hsp70表达显著增强，热休克蛋白抑制剂使Hsp70的表达显著减弱。
　　3、蛋白印迹分析表明多奈哌齐（5，10mg/kg）组与对照组（0mg/kg）相比，Hsp70的表达显著增加；多奈哌齐（第3，5天）组与对照组（第0天）相比，Hsp70的表达高峰在第3天组。
　　4、蛋白印迹分析发现多奈哌齐诱导Hsp70和Bcl-2的表达增强，热休克蛋白抑制剂抑制使Hsp70和Bcl-2的表达显著减弱，Bcl-2抑制剂明显减弱Bcl-2的表达，但对Hsp70的表达无明显影响，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　5、HE染色发现与MNU组相比，多奈哌齐+MNU组的视网膜外核层显著增厚，然而热休克蛋白抑制剂+多奈哌齐+MNU组视网膜外核层显著变薄。流式细胞分析发现对照组凋亡率为6.4±4.1％，MNU组为43.2±7.4%，多奈哌齐+MNU组为29.4±4.1%，热休克蛋白抑制剂+多奈哌齐+MNU组为40.6±2.3%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论：1、小鼠腹腔注射MNU可以显著并且选择性诱导感光细胞凋亡。
　　2、多奈哌齐能诱导Hsp70的表达，同时存在剂量和时间依赖性，另外，多奈哌齐能上调Bcl-2的表达。
　　3、多奈哌齐对感光细胞具有保护作用，其保护机制可能是通过Bcl-2抑制凋亡实现的，并且Hsp70可能是Bcl-2上游抑制凋亡的一个重要因素。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 动物和分组

2.1.2 抗体

2.1.3 免疫荧光多聚甲醛

2.1.4 蛋白免疫印迹蛋白酶抑制剂混合物RIPA

2.1.5 溶液配制

2.1.6 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 石蜡切片

2.2.2 苏木紫伊红染色法（HE染色）

2.2.3免疫荧光法

2.2.4 蛋白免疫印迹

2.2.5 流式细胞术

2.3 统计学分析

第3章 结果

3.1 腹腔注射MNU诱导感光细胞的凋亡

3.2 多奈哌齐诱导Hsp70的表达

3.3 多奈哌齐诱导Hsp70表达的剂量和时间依赖

3.4 多奈哌齐诱导Hsp70表达与Bcl-2有关

3.5 多奈哌齐通过上调Hsp70来减少 MNU诱导的感光细胞凋亡

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述:视网膜感光细胞凋亡和保护的研究