白藜芦醇抑制关节软骨细胞去分化的体外实验研究

摘要

目的
　　研究白藜芦醇对体外单层培养条件下兔关节软骨细胞去分化的影响，并探讨白藜芦醇(Resveratrol，Resv)抑制体外单层培养条件下兔软骨细胞去分化的调节机制。
　　方法
　　利用胰蛋白酶联合II型胶原酶序贯消化法分离培养正常兔髋关节原代软骨细胞，并行Alcian Blue细胞染色鉴定；实验随机分五组：空白对照组，0μM Resv组，2.5μM Resv组，5μM Resv组，10μM Resv组，分别于第1、3、5、代细胞融合达80％以上时提取RNA及蛋白；CCK-8法检测各组每代软骨细胞的在450nm的吸光度，并绘制生长曲线；β-半乳糖苷酶（ senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal）染色对去分化的衰老细胞进行染色；倒置相差显微镜下每日观察细胞形态，RT-PCR检测蛋白多糖Aggrecan，Sirt-1，p53，p21以及P16基因的表达水平；western blot检测Aggrecan，Sirt-1，p53，p21以及P16蛋白表达水平。
　　结果
　　结合Alcian Blue染色及形态学观察提示所培养细胞为兔关节软骨细胞；形态学观察及 SA-β-gal、Alcian Blue染色显示在体外连续单层培养条件下，软骨细胞易发生去分化，而一定浓度范围的白藜芦醇可以抑制软骨细胞去分化，且随着传代次数增加趋势愈明显，Alcian Blue染色提示低浓度Resv（2.5μM）组较其他组聚蛋白多糖表达水平高；β-半乳糖苷酶染色显示2.5μmol/LResv组蓝染的衰老细胞数明显减少；RT-PCR及western blot检测显示Resv能够显著上调Sirt1基因及蛋白表达水平，并下调P53，P21及P16基因的表达水平，抑制细胞去分化，且不影响细胞增殖。
　　结论
　　体外单层连续培养兔关节软骨细胞易出现去分化现象，而这一现象与细胞衰老相关，白藜芦醇可以抑制这种现象，促进细胞外基质的合成，抑制软骨细胞的去分化，这一机制与Sirt1的上调有关。