人脂肪源干细胞与纤维蛋白胶共混在裸鼠体内外的初步研究

摘要

目的：掌握人脂肪源干细胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs）的分离、培养方法，并探讨其部分生物学特性。探讨纤维蛋白胶对ADSCs增殖的影响。构建一种新型可注射型生物支架材料，为临床修复软组织缺损奠定实验基础。
　　方法：1.取脂肪抽吸术的脂质部分，用酶消化法分离获得ADSCs。倒置显微镜下观察ADSCs体外培养形态学改变。利用MTT法检测原代细胞活性并绘制细胞生长曲线；第3代（P3）细胞分别加入含胰岛素、甲基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松、吲哚美辛的条件培养基和含地塞米松、磷酸甘油、维生素C的条件培养基进行定向诱导分化成脂、成骨。油红O染色、茜素红染色定性，镜下观察ADSCs变化。2.体外培养人ADSCs，取P3细胞接种到96孔板，以不同浓度（纤维蛋白原与凝血酶比例：4∶1、2∶1、8∶3、5∶2）纤维蛋白胶浸润提取液培养，用MTT法检测ADSCs在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。3.体内实验分5组：A组：单纯纤维蛋白胶组，选用低浓度（纤凝比4:1）纤维蛋白胶；B组：单纯纯化后的脂肪颗粒组；C组：单纯ADSCs组，细胞浓度为3×106/ml；D组：细胞-脂肪复合物，细胞浓度为3×106/ml与纯化后的脂肪颗粒1:1混合；E组：细胞-支架复合物，细胞浓度为3×106/ml与纤维蛋白胶1:1混合。每组0.3ml分别注射至裸鼠背部皮下，5点/只，共10只。观察各组植入后，裸鼠的生命体征及局部变化，8周后取出，分别进行体积、湿重测定、HE染色等分析。
　　结果：原代细胞显示3-4h开始贴壁，最初呈类圆形，2-4d逐渐延伸，呈典型成纤维细胞。5d左右进入对数生长期，2-3周单层细胞融合率可达90％左右，细胞排列紧密成旋涡状。传代后2-4h开始贴壁，增殖迅速，2-4d即可达80%。一般3-8代细胞增殖活跃，之后稍减弱。P3细胞分化成脂、成骨，油红O染色镜下可见细胞中间有脂滴，茜素红染色可见椭圆形结节状结构。不同浓度纤维蛋白胶制备的浸润提取液所培养的ADSCs生长曲线无明显差异。本次实验10只裸鼠，植入复合物后生命体征平稳，注射部位未见明显炎症反应，B、D、E组均可见新生组织形成，A、C组未见组织。大体观察，B组和D组可见明显脂肪颗粒，E组可见新生组织，但略少于B、D组。HE染色B、D、E组均可见脂肪细胞，D组富含胶原蛋白及脂肪颗粒。体积：D组＞B组＞E组；湿重：D组＞B组＞E组。
　　结论：构建了一种简单有效的体外分离和培养ADSCs的方法，ADSCs生长旺盛、增殖快，具有多向分化潜能，可以作为组织工程理想的种子细胞。不同浓度纤维蛋白胶对ADSCs的增殖无明显影响，纤维蛋白胶有望成为ADSCs生长的支架材料。ADSCs能在纤维蛋白胶上黏附、生长，纤维蛋白胶可以作为ADSCs的载体和组织工程支架材料。

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中英文缩略词表

第1章前言

第2章材料与方法

2.1实验组织及动物

2.2主要仪器

2.3主要试剂

2.4主要试剂配制方法

2.5方法

第3章结果

3.1 ADSCs形态学表现

3.2 ADSCs的传代培养

3.3细胞生长曲线

3.4油红O染色观察

3.5茜素红染色

3.6纤维蛋白胶浸润液对ADSCs增殖的影响

3.7注射植入物后裸鼠局部反应观察

3.8新生组织体积比较

3.9新生组织湿重比较

3.10新生组织HE染色

第4章讨论

第5章结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:可注射型支架材料在组织工程脂肪中的应用