HBV rtA181T突变致TGFBI启动子甲基化

摘要

目的：
　　构建重组质粒，转染LO2细胞，明确HBV rtA181T截短表面蛋白在细胞内的作用位点TGFBI，探讨rtA181T截短表面蛋白致癌与TGFBI启动子甲基化之间可能存在的关系。
　　方法：
　　1.根据HBsAg基因序列(GeneBank:M74498.1)，设计引物，RT-PCR方法获得HBsAg cDNA，克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP，构建pIRES2真核表达重组质粒pIRES2-HBsAg；
　　2.以重组质粒 pIRES2-HBsAg为模板，采用定点突变方法获得突变质粒pIRES2-HBsAg(rtA181T)；
　　3. p-HBsAg作为对照，rtA181T重组质粒转染LO2细胞，应用染色质免疫共沉淀法(CHIP-seq)，探测分析HBV rtA181T截短表面蛋白在细胞DNA的作用位点。
　　4.根据CHIP-seq结果，构建pGL3-TGFBI(UCSC：NM_000358)启动子重组质粒，分别与p-HBsAg、rtA181T共转染LO2细胞，24 h后用0.5 nM TGF-β处理，继续培养24 h后进行荧光素酶报告基因实验；
　　5. p-HBsAg、rtA181T分别转染LO2细胞，转染24 h后用0.5 nM TGF-β处理细胞24 h。收集细胞总RNA，RT-qPCR检测TGFBI mRNA的表达水平；收集细胞总蛋白，Western blot检测TGFBI蛋白的表达变化；
　　6. p-HBsAg、rtA181T分别转染LO2细胞，转染48 h后MSP法检测TGFBI启动子甲基化状态；相同分组转染24 h后用5-Aza处理24 h，RT-qPCR检测各组TGFBI表达水平；Western blot检测Cyclin D1、pCREB的表达量，观察rtA181T型突变下调TGFBI对Cyclin D1、pCREB表达的影响。
　　结果：
　　1. pIRES2-HBsAg、pIRES2-HBsAg(rtA181T)重组质粒双酶切后用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置大小与目的片段一致；测序结果符合实验要求。
　　2. p-HBsAg、rtA181T转染LO2细胞后，CHIP-seq实验分析结果显示rtA181T截短表面蛋白可与TGFBI启动子结合。
　　3.成功构建 pGL3-TGFBI启动子重组质粒，测序结果符合实验要求；pGL3-TGFBI+Control、pGL3-TGFBI+p-HBsAg和pGL3-TGFBI+rtA181T三组质粒转染 LO2细胞后，荧光素酶活性检测显示，rtA181T组的荧光素酶活性较p-HBsAg组明显偏低。
　　4. p-HBsAg、rtA181T转染LO2细胞后，RT-qPCR结果显示，在LO2细胞中，经由TGF-β诱导24 h后，与对照组比较，p-HBsAg组TGFBI的mRNA表达显著增加，但 rtA181T组无明显差异；且无论有无 TGF-β诱导，rtA181T组TGFBI的mRNA表达量与Control组和p-HBsAg组相比都明显较低；Western blot检测结果显示也是一样，与RT-qPCR结果存在一致性，说明rtA181T截短表面蛋白能够下调TGFBI表达。
　　5. Control组、p-HBsAg组和rtA181T组三种质粒转染LO2细胞48 h后， TGFBI启动子甲基化状态检测结果也可以看出只有 rtA181T组没有出现未被甲基化的状态；相同转染分组使用5-Aza处理后，p-HBsAg组与Control组相比， TGFBI表达量无明显变化，但rtA181T组表达被逆转；western blot检测Cyclin D1、pCREB蛋白表达量，结果显示rtA181T组Cyclin D1、pCREB蛋白表达量明显上调。
　　结论：HBV rtA181T截短表面蛋白下调 TGFBI表达，可能与其使 TGFBI启动子甲基化有关。

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中英文对照词表

第1章引言

第2章 材料与方法

2.1 实验主要试剂和材料

2.1.1血液标本、细胞株及质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3实验主要设备和仪器

2.1.4 实验主要试剂的配制

2.2实验方法与步骤

2.2.1 LO2细胞培养

2.2.2 pIRES2-HBsAg、pIRES2-HBsAg（rtA181T）、pGL3-TGFBI启动子重组质粒的构建

2.2.3 pIRES2-HBsAg（rtA181T）重组质粒的构建

2.2.4基因转导技术

2.2.5 染色质免疫共沉淀技术（CHIP-seq）

2.2.6启动子荧光素酶报告基因载体活性鉴定

2.2.7 RT-qPCR检测细胞中TGFBI 的mRNA表达水平

2.2.8 Western blot法检测蛋白表达的变化

2.2.9 TGFBI启动子甲基化状态检测

2.2.10 数据处理

第3章 结果

3.1 重组质粒pIRES2-HBsAg 、PIRES2-HBsAg（rtA181T）、pGL3-TGFBI的测序鉴定

3.2 CHIP-seq技术寻找rtA181T截短表面蛋白在胞核内的作用位点

3.3 rtA181T截短表面蛋白异常调节TGFBI表达

3.4 TGFBI启动子甲基化检测

3.5 rtA181T截短表面蛋白致癌活性与Cyclin D1蛋白表达升高相关

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

综述: 乙肝病毒突变临床意义的研究进展