靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用

摘要

本发明公开了一种质粒，核酸序列如SEQ ID No:1所示；还公开了一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型，是将如SEQ ID No:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到的能够稳定表达Gluc的细胞系；还公开了药物筛选细胞模型的构建方法；还公开了该细胞模型在筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物中的应用。本发明构建的靶向HBV核心启动子的抗HBV药物细胞模型可以用来高通量地筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物，从而有助于开发新型抗HBV药物，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有非常好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种药物筛选细胞模型，具体涉及一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一项严重的公共卫生问题，其涉及范围广泛，全球有近4亿慢性感染患者，而慢性HBV感染可以导致肝硬化、肝细胞癌等严重后果，每年因此死亡者近百万，在我国，需要治疗的慢乙肝患者约有2500万。

HBV属于嗜肝DNA病毒。HBV感染细胞后，在胞浆脱去包膜，其基因组(rcDNA)被运送释放到细胞核，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)，cccDNA是各种病毒蛋白mRNA的转录模板，在宿主细胞RNA聚合酶II、转录因子及转录调节因子作用下，产生3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.7kb mRNA。3.5kb的前基因组RNA(pgRNA)可翻译产生Core及Pol蛋白，Core、Pol与pgRNA相互作用，在形成核壳的同时将pgRNA及Pol蛋白包裹进核壳，在核壳内，Pol以pgRNA为模板，先合成负链DNA，然后以该链为模板合成正链，含有成熟rcDNA的核心颗粒在内质网被外膜蛋白包裹然后分泌出胞。

从上述HBV在细胞内的复制过程可知，从cccDNA转录产生pgRNA是很重要的步骤。pgRNA的转录是由HBV核心启动子来起始的。1992年，Yuh等研究发现，HBV nt1744-1851是C启动子最短必需序列，称为基本核心启动子(basic core promoter,BCP)，它可以保证prC/pgRNA的正确转录；而nt1636-1744整体上能强烈促进C启动子活性(在HepG2细胞中使其活性增加1900倍)，称为C启动子上游调控序列(core upstream regulatory sequence,CURS)；CURS与增强子II(EN II)位于同一区域，CURS本身没有启动子活性，它对BCP的激活作用具有位置和方向依赖性，因而区别于EN II。在EN II上游，还存在另一增强子，即ENII，对核心启动子的活性也有促进作用。由于pgRNA转录，是HBV复制过程必不可少的环节，因此干扰该环节有可能成为治疗HBV感染的一种有效策略。然而，目前缺乏针对pgRNA转录环节的有效药物，因此筛选针对该环节的药物十分必要。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种靶向HBV核心启动子转录的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用。

本发明一方面提供了一种质粒，所述质粒的核酸序列如SEQ ID No:1所示。

本发明的另一方面提供了一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型，是将如SEQ ID No:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到的能够稳定表达Gluc的细胞系。

所述体外细胞A为293FT细胞，所述慢病毒是将SEQ ID No:1所示的质粒、psPAX2和Pmd2.0G共转染293FT细胞制备得到。

所述体外培养细胞B为HepG2细胞。

本发明的另一方面提供了一种上述的靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型的构建方法，是将如SEQ ID No:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到能够稳定表达Gluc的细胞系，即得。

在上述技术方案中，所述体外培养细胞为HepG2细胞。

本发明的另一方面提供了上述的细胞模型在筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明得到的质粒plenti-Gluc-neo可以成功应用于药物筛选模型细胞系Hep-pcore-Gluc的构建当中，构建的药物筛选模型细胞系Hep-pcore-Gluc经实验证明能够稳定表达Gluc，成功筛选出了能够对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物。本发明构建的靶向HBV核心启动子的抗HBV药物细胞模型可以用来高通量地筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物，从而有助于开发新型抗HBV药物，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有非常好的应用价值。

附图说明

图1是质粒plenti-Gluc-neo质粒结构示意图。

图2是用本发明细胞模型进行化合物筛选的流程示意图。

图3是用本发明细胞模型进行化合物初步筛选的部分结果图。

具体实施方式

本发明实施例中所用试剂来源如下：

2×PrimeSTAR HS Mix：Takara公司，日本

胶回收试剂盒，基因组DNA提取试剂盒：QIAGEN公司，德国

质粒模板PCH9/3091由德国弗莱堡大学Michael Nassal构建

质粒lentiCRISPRv2、psPAX2及Pmd2.0G由美国麻省理工大学张峰博士实验室构建，从美国公司Addgene购买

质粒模板pCMV-Gluc：New England Biolabs公司，美国

质粒模板pEGFP-N1：Clontech公司，美国

大肠杆菌JM109、Rellina荧光素酶检测试剂盒，Glomax荧光素酶检测仪：Promega公司，美国

BsmB I、Tango buffer、DTT、Puromycin：Thermo scientific公司，美国

DMEM：GIBICO公司，美国

X-tremeGNEN HP转染试剂：Roche公司，德国

T7ligase：Enzymatics公司，美国

ATP：New England Biolabs公司，美国

PEG-it^TMVirus>

Polybrene：Sigma公司，美国

G418：Invitrogen公司，美国

293FT细胞：Invitrogen公司，美国

HepG2细胞：美国模式菌种收集中心

本发明实施例中所用扩增引物序列如下：

实施例1 Hep-pcore-Gluc稳定表达细胞系构建

一、核心启动子启动的Gaussia报告质粒plenti-pcore-Gluc构建

以质粒PCH9/3091为模板，扩增包含增强子I，增强子II(CURS)和基本核心启动子(BCP)的区域。反应体系为：质粒PCH9/3091 10ng，引物F1070GG2(10μM)及R1901GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag1。

以质粒lentiCRISPRv2为模板，用两个PCR反应，扩增慢病毒载体骨架。扩增反应体系为：质粒lentiCRISPRv2 20ng，引物F lentiv2flag(10μM)及R lentiv2 13773(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃2min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag2。

片段frag3扩增反应体系为：质粒lentiCRISPRv2 20ng，引物Flentiv213769(10μM)及Rlentiv22607(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃2min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag3。

片段frag4扩增反应体系为：质粒pCMV-Gluc 10ng，引物FGluc1gg(10μM)及RGlucGG2(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，55℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag4。

将以上得到的四个片段frag1、frag2、frag3和frag4做Golden gate连接反应，反应体系为：

BsmB I酶0.75μlTango buffer1μlDTT1μlT7 ligase0.25μlATP1μlfrag11μl(50ng)frag22μl(100ng)frag32μl(100ng)frag41μl(50ng)总体积10μl

反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。

Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒plenti-pcore-Gluc。

二、质粒plenti-Gluc-neo构建

本步将plenti-pcore-Gluc上的puromycin抗性基因替换为neomycin抗性基因。

首先以plenti-pcore-Gluc为模板，扩增frag5，反应体系为：plenti-pcore-Gluc质粒20ng，引物Flentiv213769(10μM)及R2AGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃2min 30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag5。

扩增frag6，反应体系为：pEGFP-N1质粒10ng，引物FneoGG(10μM)及RneoGG(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃40s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag6。

扩增frag7，反应体系为：plenti-pcore-Gluc质粒20ng，引物Flentiv29947(10μM)及Rlentiv213773(10μM)各1μl，2XPrimeSTAR HS Mix 25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃2min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag7。

将以上得到的三个片段frag5、frag6、frag7做Golden gate连接反应，反应体系为：

H₂O1μlBsmB I酶0.75μlTango buffer1μlDTT1μlT7 ligase0.25μlATP1μlfrag52μl(100ng)frag61μl(50ng)frag72μl(100ng)总体积10μl

反应条件：37℃5min，20℃5min，循环25次。80℃20min灭活反应。

Golden gate产物转化JM109感受态细菌，涂板，克隆初筛，测序鉴定，正确的克隆命名为质粒plenti-Gluc-neo(其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)，其结构如图1所示，Gluc与neomycin抗性基因通过2A序列连接，由HBV核心启动子启动表达。

三、plenti-Gluc-neo慢病毒制备

用含10％胎牛血清的DMEM培养培养基培养293FT细胞，质粒转染前约20小时，将293FT细胞以约50％密度接种到10cm细胞培养皿，第二天，用Roche公司X-tremeGENE HP转染试剂将10ug质粒plenti-Gluc-neo，7.5ug psPAX2和2.5ug Pmd2.0G共转染293FT细胞，具体操作按厂商说明书进行。转染后第二天更换新鲜培养基，转染后48小时，收集细胞培养上清，并用SBI公司慢病毒浓缩试剂PEG-it^TMVirus>

四、Hep-pcore-Gluc稳定表达细胞系构建

用含10％胎牛血清的DMEM培养培养基培养HepG2细胞，慢病毒感染前约20小时，将HepG2细胞以约50％密度接种到6cm细胞培养皿，第二天，待细胞密度达到约90％时，更换新鲜培养基后(4ml，无双抗)，加入200μl浓缩慢病毒及2μl polybrene(10mg/ml)。48小时后，将感染慢病毒的细胞消化传代至10cm培养皿，同时用含有500μg/ml G418的培养基做筛选培养，约2-3周后，取上清检测Gluc活性，可见有较高量的Gluc表达(高于阴性对照10,000倍以上)，提示已获得稳定表达Gluc的混合克隆细胞系Hep-pcore-Gluc。

实施例2化合物筛选

利用实施例1中得到的细胞系Hep-pcore-Gluc，筛选了一个含有218种天然化合物的库，以及一个含有368种化学合成化合物的库。具体筛选流程如下(如图2所示)：复苏Hep-pcore-Gluc细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中，将细胞以约70％汇合度接种于96孔板。细胞接种后约6小时待细胞贴壁后，将待测化合物分别加入96孔板中，终浓度为20μM，每种化合物做3个复孔。加药后约48小时，每空吸取培养上清20μl，分别加入黑边透明底的96孔板中，然后在每孔加入Gluc检测试剂(NEB)20μl，用Synergy H1多孔板检测仪(Bio-Tek)检测Gluc活性。

在筛选的这586种化合物中，能使Gluc活性降低2倍或以上的共有15种(图3显示了代表性筛选结果)，能使Gluc活性升高2倍或以上的化合物有11种，这些分子可以作为候选分子进行更深入研究。这些筛选结果表明，不同药物对Hep-pcore-Gluc细胞中的Gluc活性有不同影响，该细胞模型可以方便快捷地对影响HBV核心启动子活性的药物进行初步筛选，为后续药物研发提供候选化合物。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用

<130> 1

<160> 13

<210> 1

<211> 9821

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 质粒plenti-Gluc-neo的核酸序列

<400> 1

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240

attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600

tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660

ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720

accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780

gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320

tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380

caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440

aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500

aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560

agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620

gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680

ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740

acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800

ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860

ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920

tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980

aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040

aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100

aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160

acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220

agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280

tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340

gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400

gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460

tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520

agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580

agatccagtt tggttaatta aggtacctga ccgttgatgc ctttgtatgc atgtattcaa 2640

tctaagcagg ctttcacttt ctcgccaact tacaaggcct ttctgtgtaa acaatacctg 2700

aacctttacc ccgttgcccg gcaacggcca ggtctgtgcc aagtgtttgc tgacgcaacc 2760

cccactggct ggggcttggt catgggccat cagcgcatgc gtggaacctt ttcggctcct 2820

ctgccgatcc atactgcgga actcctagcc gcttgttttg ctcgcagcag gtctggagca 2880

aacattatcg ggactgataa ctctgttgtc ctatcccgca aatatacatc gtttccatgg 2940

ctgctaggct gtgctgccaa ctggatcctg cgcgggacgt cctttgttta cgtcccgtcg 3000

gcgctgaatc ctgcggacga cccttctcgg ggtcgcttgg gactctctcg tccccttctc 3060

cgtctgccgt tccgaccgac cacggggcgc acctctcttt acgcggactc cccgtctgtg 3120

ccttctcatc tgccggaccg tgtgcacttc gcttcacctc tgcacgtcgc atggagacca 3180

ccgtgaacgc ccaccaaata ttgcccaagg tcttacataa gaggactctt ggactctcag 3240

caatgtcaac gaccgacctt gaggcatact tcaaagactg tttgtttaaa gactgggagg 3300

agttggggga ggagattagg ttaaaggtct ttgtactagg aggctgtagg cataaattgg 3360

tctgcgcacc agcaccatgc aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc 3420

tactgttcaa gcctccaagc tgtgccttgg gtggctttgg ggcatgggag tcaaagttct 3480

gtttgccctg atctgcatcg ctgtggccga ggccaagccc accgagaaca acgaagactt 3540

caacatcgtg gccgtggcca gcaacttcgc gaccacggat ctcgatgctg accgcgggaa 3600

gttgcccggc aagaagctgc cgctggaggt gctcaaagag atggaagcca atgcccggaa 3660

agctggctgc accaggggct gtctgatctg cctgtcccac atcaagtgca cgcccaagat 3720

gaagaagttc atcccaggac gctgccacac ctacgaaggc gacaaagagt ccgcacaggg 3780

cggcataggc gaggcgatcg tcgacattcc tgagattcct gggttcaagg acttggagcc 3840

catggagcag ttcatcgcac aggtcgatct gtgtgtggac tgcacaactg gctgcctcaa 3900

agggcttgcc aacgtgcagt gttctgacct gctcaagaag tggctgccgc aacgctgtgc 3960

gacctttgcc agcaagatcc agggccaggt ggacaagatc aagggggccg gtggtgacga 4020

ttacaaagac gatgacgata agggatccgg cgcaacaaac ttctctctgc tgaaacaagc 4080

cggagatgtc gaagagaatc ctggaattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 4140

cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 4200

tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 4260

gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 4320

gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 4380

attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 4440

atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 4500

cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 4560

cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 4620

gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 4680

gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 4740

tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 4800

cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 4860

catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaacg cgttaagtcg acaatcaacc 4920

tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4980

gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 5040

cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 5100

tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 5160

cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 5220

ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 5280

tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 5340

tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 5400

ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 5460

ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cgtcgacttt aagaccaatg 5520

acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg 5580

ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta 5640

gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 5700

taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 5760

tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagggc ccgtttaaac 5820

ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 5880

cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 5940

aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 6000

cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 6060

ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag 6120

cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 6180

cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 6240

tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 6300

cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 6360

gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 6420

aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 6480

gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt 6540

ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 6600

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 6660

gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 6720

actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 6780

ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag 6840

tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata 6900

tccattttcg gatctgatca gcacgtgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca 6960

tagtataata cgacaaggtg aggaactaaa ccatggccaa gttgaccagt gccgttccgg 7020

tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct 7080

cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca 7140

tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg 7200

gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct 7260

ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg 7320

acccggccgg caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgacac gtgctacgag 7380

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 7440

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact 7500

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 7560

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 7620

atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 7680

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 7740

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 7800

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 7860

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 7920

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 7980

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 8040

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 8100

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 8160

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 8220

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 8280

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 8340

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 8400

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 8460

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 8520

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 8580

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 8640

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 8700

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 8760

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 8820

ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 8880

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 8940

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 9000

caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 9060

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 9120

tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 9180

cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 9240

aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 9300

tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 9360

gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 9420

cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 9480

aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 9540

tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 9600

tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 9660

gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 9720

atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 9780

taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga c 9821

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F1070GG2

<400> 2

gctgaccgtc tcctgaccgt tgatgccttt gtatgcatgt 40

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R1901GG

<400> 3

gctgaccgtc tctagacgac atgccccaaa gccacccaag gct 43

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Flentiv2flag

<400> 4

gctgaccgtc tccgattaca aagacgatga cgataag 37

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Rlentiv22607

<400> 5

actcaccgtc tctgtcaggt accttaatta accaaactgg 40

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> FGluc1gg

<400> 6

gctgaccgtc tcccatggga gtcaaagttc tgtttg 36

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> RGlucGG2

<400> 7

actcaccgtc tctaatcgtc accaccggcc cccttgat 38

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R2AGG

<400> 8

tgcgtccgtc tcttccagga ttctcttcga catct 35

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> FneoGG

<400> 9

gctgaccgtc tcctggaccg attgaacaag atggattg 38

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> RneoGG

<400> 10

actcaccgtc tctttcactc agaagaactc gtcaagaag 39

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Flentiv213769

<400> 11

gctgaccgtc tccagggatt ttggtcatga gattatc 37

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Rlentiv213773

<400> 12

actcaccgtc tctcccttaa cgtgagtttt cgttcca 37

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Flentiv29947

<400> 13

gctgaccgtc tcctgaacgc gttaagtcga caatca 36