肌萎缩侧索硬化G93A SOD1转基因小鼠脑内源性神经前体细胞增殖,迁移,分化的实验研究

摘要

目的：
　　观察分析成年正常野生型小鼠及不同发病阶段 G93A-SOD1 ALS转基因小鼠脑相关解剖区NPCs的增殖、迁移、分化情况，为进一步调控NPCs的增殖、定向迁移、分化提供理论依据，为治疗ALS提供可能途径。
　　方法：
　　构建G93A-SOD1 C57BL/6J转基因小鼠动物模型，用PCR技术检测筛选转基因小鼠动物模型。将G93A-SOD1转基因小鼠分为未发病阶段（60-70天），发病阶段（90-100天）和进展阶段（120-130天）。腹腔注射Brdu（5-溴脱氧尿核苷）标记野生型和 G93A-SOD1 C57BL/6J转基因小鼠增殖的新生细胞。采用荧光免疫组织化学双标技术，用NPCs生物学标志物（Nestin, Vimentin）标记NPCs，用Brdu标记增殖的新生细胞，用NeuN标记神经元细胞，用GFAP标记星形胶质细胞，用 Olig标记少突胶质细胞。在显微镜同一视野、同一放大倍数下，用图像处理技术将不同染色的阳性细胞两两叠加成像，观察是否存在共免疫反应。统计不同发病阶段不同解剖区阳性细胞数量，观察阳性细胞分布特征。分析野生型和G93A-SOD1转基因小鼠脑相关解剖区NPCs增殖、定向迁徙、分化特征。结果：
　　1、VCCs广泛分布于成年野生型小鼠脑的多个部位，包括室管膜区、室管膜下区、海马、大脑皮层、嗅球。
　　2、G93A-SOD1 ALS转基因小鼠脑干腹侧多个核团出现VCCs的表达，随着疾病的进展，VCCs阳性细胞数进行性增多，存在进展组＞起病组＞未发病组的规律。
　　3、脑干增多的VCCs几乎全与GFAP存在共免疫反应性，提示VCCs几乎全部分化成星形胶质细胞。
　　4、与正常对照相比，G93A-SOD1 ALS转基因小鼠的嗅皮层、扣带回、运动皮层的VCCs数量减少。
　　5、增多的VCCs极少数BrdU阳性，提示增多的VCCs可能有两种来源：1）少数与BrdU存在共免疫反应的VCCs为增殖的新生细胞；2）大多数与BrdU不存在共免疫反应的VCCs可能是增殖分化晚期的NPCs，这部分VCCs也有可能是从其他部位迁移分化而来。
　　6、在G93A-SOD1 ALS转基因小鼠脑桥与延髓，所有nestin阳性细胞均表达Vimentin，仅有一部分Vimentin阳性细胞与nestin存在共免疫反应，说明VCCs大部分是分化晚期的NPCs。
　　结论：
　　正常成年野生型小鼠脑内多个部位广泛存在大量 NPCs。ALS的发病刺激NPCs在脑干腹侧多个核团大量增殖，小部分处于增殖早期，大部分处于增殖分化晚期，并大多分化为星形胶质细胞。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要实验设备

2.1.4 主要实验试剂配制

2.2 方法

2.2.1 构建C57BL/6J G93A-SOD1 转基因小鼠动物模型

2.2.2 PCR技术检测和筛选转基因小鼠动物模型

2.2.3实验分组

2.2.4 标本取材及处理

2.2.5 冰冻切片

2.2.6 荧光双标免疫组化

2.2.7 BrdU标记及染色方法

2.2.8 阳性细胞的观察和数据收集

2.2.9统计分析和图像处理

第3章 结果

3.1 PCR凝胶电泳结果

3.2 荧光免疫组化染色结果

3.2.1 Vimentin阳性细胞在对照组小鼠脑的分布

3.2.2 Vimentin阳性细胞在实验组小鼠脑的表达变化

3.2.3荧光双标免疫组化结果

第4章 讨论

4.1 NPCs在正常成年小鼠脑内的分布

4.2 NPCs在实验组小鼠脑的分布变化

4.3 NPCs在实验组小鼠脑的迁移分化

4.4 Vimentin与nestin表达差异

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:病毒感染与肌萎缩侧索硬化