MicroRNA-29a调控IL-13介导的转录因子YY1在肺癌侵袭转移中的作用及机制的研究

摘要

目的：
　　IL-13是多效能细胞因子，广泛参与纤维化、炎症和肿瘤的发生发展。最新研究表明IL-13在肺纤维化体外模型中可以通过PI3K/AKT通路介导转录因子YY1产生从而发挥信号功能，本研究旨在探讨在肺癌细胞中IL-13是否也能通过PI3K/AKT通路介导 YY1产生从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移，以及miR-29a对该过程的调控作用。转录因子YY1是锌指类转录因子家族中的一员，其激活或失活可以促进肿瘤的发展、细胞的生长，但是在肿瘤的发生和发展中YY1的功能还有待明确。研究表明microRNA(miRNA)参与肿瘤细胞发育、分化、凋亡和增殖的调控。其中miR-29a在细胞凋亡中与多个凋亡因子有关，它们相互作用，从而抑制肿瘤细胞的生长。本课题首先用不同浓度和时间的IL-13外源性刺激肺癌A549细胞后观察YY1的表达水平和AKT的磷酸化情况；再观察miR-29a对肺癌A549细胞增殖、凋亡和侵袭的影响；最后观察miR-29a对IL-13介导的YY1表达的影响，进而探讨IL-13、YY1及miR-29a之间的关系，判断IL-13在肺癌细胞中是否通过PI3K/AKT通路介导YY1产生，以及miR-29a是否通过调节YY1的表达从而影响肺癌细胞的增殖及侵袭迁移能力。
　　方法：
　　1、观察IL-13介导转录因子YY1表达的信号通路的影响。IL-13不同浓度和不同时间处理A549细胞后，利用qRT-PCR检测细胞内YY1的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹法检测细胞内YY1的蛋白表达水平和AKT的磷酸化程度。
　　2、观察PI3K/AKT通路对IL-13诱导的YY1mRNA和蛋白水平及A549细胞增殖和迁移能力的影响。实验分组：空白对照组、IL-13刺激组、LY294002(p-AKT抑制剂)组、IL-13＋LY294002组。A549细胞汇合度达到80％后，换成正常培养基或含有相应药物的培养基，处理相应时间后采用qRT-PCR检测YY1的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹检测YY1的蛋白表达水平和AKT的磷酸化程度。细胞划痕和MTT检测细胞的迁移和增殖能力。
　　3、观察miR-29a对A549细胞体外生物学功能的影响。将miR-29a质粒、miR-29a抑制剂及miR-29a阴性对照转染至A549细胞，实时荧光定量PCR检测miR-29a的表达量；然后利用流式细胞术检测miR-29a对A549细胞凋亡功能的影响；最后采用MTT和Transwell小室法检测miR-29a对A549细胞增殖和侵袭的影响。
　　4、观察miR-29a下调IL-13介导的转录因子YY1的表达对A549细胞的侵袭迁移能力的影响。实验分组：空白组、miR-29a组、IL-13刺激组、IL-13＋miR-29a组。各组细胞汇合度达到80%后，换成正常培养基或含有相应药物的培养基，处理相应时间后采用qRT-PCR检测YY1的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹检测YY1的蛋白表达水平。MTT和Transwell小室检测A549细胞的增殖和侵袭能力。
　　结果：
　　1、外源性IL-13肺癌细胞A549刺激后可在一定浓度（40ng/ml）和时间(12h）使YY1和P-AKT合成达到最大值，并促进A549细胞的增殖和迁移能力。
　　2、LY294002不仅抑制YY1在A549细胞中的mRNA和蛋白表达，而且抑制A549细胞的增殖和迁移能力。
　　3、miR-29a的表达增高能抑制A549细胞增殖，减弱细胞侵袭能力，并加速其凋亡。
　　4、miR-29a抑制A549细胞中YY1的mRNA和蛋白表达，也抑制A549细胞的增殖和侵袭；IL-13能促进A549细胞中YY1的mRNA和蛋白表达，促进A549细胞的增殖和侵袭；当二者共同存在时，miR-29a能在一定程度上抑制IL-13的促A549细胞YY1的表达及细胞增殖侵袭作用。
　　结论：
　　综上所述，IL-13在一定浓度和时间作用下能诱导A549细胞YY1mRNA和蛋白的表达，在一定程度上影响AKT的磷酸化，加速细胞增殖和侵袭。PI3K/AKT阻断剂LY294002能抑制IL-13介导的转录因子YY1表达，并抑制肺癌A549细胞增殖和迁移。miR-29a能抑制肺癌A549细胞YY1的生成，并抑制该细胞的增殖和侵袭及加速其凋亡。当IL-13和miR-29a二者同时作用于A549细胞后，可中和上述作用。因此说明在肺癌A549细胞中IL-13能通过PI3K/AKT通路介导YY1产生并促进细胞的增殖和迁移侵袭能力，miR-29a可对该过程进行调控。

目录

声明

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 结果

3.1 不同浓度IL-13刺激下A549细胞YY1、P-AKT的mRNA和蛋白表达情况

3.2 不同时间IL-13刺激下A549细胞YY1、P-AKT的mRNA和蛋白表达情况

3.3 PI3K/AKT通路阻断剂LY294002对A549细胞中YY1、P-AKT的mRNA和蛋白的影响

3.4 PI3K/AKT通路阻断剂LY294002对A549细胞增殖迁移的影响

3.5转染miR-29a后A549细胞中YY1、P-AKT的mRNA和蛋白表达

3.6 miR-29a的转染效率以及对细胞的影响

3.7 miR-29a调控IL-13对A549细胞中YY1的mRNA和蛋白的表达

3.8 miR-29a调控IL-13对A549细胞增殖和侵袭的影响

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:MicroRNA和YY1对肿瘤的调控作用及相互间的影响