等离子共振传感器定量检测黄曲霉毒素B1的研究和玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的评价

摘要

真菌毒素是真菌生长过程中产生的次级代谢产物，广泛存在于食品及饲料中，严重危害人和动物的健康。因此，建立快速灵敏的真菌毒素检测方法对于食品和饲料的安全监管具有重要的意义。免疫学检测方法基于抗原抗体的特异性结合，灵敏度高且简单易操作。本研究建立了适于真菌毒素的免疫学快速检测方法。由于ELISA方法具有检测时间短、前处理简单、低成本、高灵敏度等优点，具有广泛的应用前景，本课题建立了适用于黄曲霉毒素B1（AFB1）的高灵敏ELISA检测方法；由于等离子共振传感器有免标记，实时监测，高灵敏等优点，建立了适于黄曲霉毒素B1定量检测的等离子共振传感器方法；此外，为了获得理想的检测结果，制备了玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，该免疫亲和柱可作为有效的样品前处理净化手段，结合其他检测方法可实现玉米赤霉烯酮高灵敏检测。
　　1、通过基质辅助激光解离飞行时间质谱对合成偶联产物AFB1-BSA进行鉴定，监控其是否制备成功；该抗原用于ELISA检测中，测得AFB1单抗的效价为1:8000，建立的间接竞争ELISA实验方法IC50值为0.224 ng/mL，该抗体对AFB1结构类似物有较高的交叉反应，适用于检测黄曲霉毒素类物质；应用此抗体建立间接竞争ELISA方法，对加标花生样品进行测定，回收率为103.45-132.29％，变异系数为0.74-9.07%，与LC-MS/MS验证试验测定结果相一致。
　　2、优化了金膜表面自组装单层膜形成条件（裸金片浸泡温度及时间）、抗原进样流速、耦合缓冲液、抗原浓度、反应缓冲液、抗体反应浓度和洗脱条件等参数，确定了等离子共振传感器定量检测黄曲霉毒素B1的最佳条件：金片浸泡于4℃、1 mM的巯基十一烷酸乙醇溶液中12 h，抗原进样流速为20μL/min，耦合缓冲液为离子浓度10 mM，pH4.5的醋酸钠缓冲液，抗原浓度为30μg/mL，固定时间为12.5 min；反应缓冲液为HBS缓冲液，抗体浓度为15μg/mL，反应时间为15 min，流速为20μL/min。该方法对AFB1的最低检测限为0.312 ng/mL，线性范围是0.625-10 ng/mL。与AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反应率分别为72%、33%、43%和48%，表明此方法除了可检测AFB1外，还可用于黄曲霉毒素总量的检测。
　　3、对制备的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的性能进行评价。该免疫亲和柱对ZEN的平均柱容量为580 ng/0.3 mL凝胶；柱空白为0；1 mL甲醇可以将添加标准品洗脱95%以上；连续使用5次后柱容量将下降到初始柱容量的50%。该免疫亲和柱对其它五种玉米赤霉烯酮类似物有较高的交叉反应率，对ZAN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL和β-ZAL交叉反应率分别为68.4%、63.6%、113.9%、74.4%和90.1%，可用于同时对玉米赤霉烯酮类真菌毒素的富集前处理。当向玉米粉样品中添加的ZEN标准品浓度分别为200 ng/g、500 ng/g和1000 ng/g时，回收率为90.87-121.65%，变异系数为7.00-14.27%，说明此免疫亲和柱可用于实际样品的快速前处理净化。

目录

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缩略语表

第一章 引言

1.1 概述

1.2 真菌毒素概述

1.3 AFB1检测方法的研究进展

1.4 表面等离子共振传感技术

1.5 玉米赤霉烯酮的样本前处理净化方法

1.6 免疫亲和层析技术的研究进展

1.7 主要研究内容和意义

第二章 AFB1-BSA全抗原和抗AFB1单克隆抗体的评价

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 小结

第三章 等离子共振传感器定量检测黄曲霉毒素B1的研究

3.1 前言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 小结

第四章 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的评价

4.1 前言

4.2 材料与仪器

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录1 试剂药品

附录2 仪器设备

附录3 试剂配制

个人介绍

攻读学位期间的研究成果