基于AMPK/RIP140信号通路探讨二甲双胍的抗肝癌作用

摘要

目的：探讨二甲双胍抗肝癌机制中受体相互作用蛋白140（ Receptor Interacting Protein140,RIP140）的作用以及AMPK对RIP140的调控作用。 方法： 1、分别构建AMPK下调、RIP140下调的人肝癌SMMC7721细胞模型，利用实时荧光定量PCR（Q-PCR）和Western blot(WB)法鉴定细胞模型. 2、实验一：将实验分为三组：空白对照（ Control）组、AMPK下调（AMPK/siRNA）组、RIP140下调(RIP140/siRNA)组，Western blot检测细胞内AMPK、P-AMPK、RIP140等蛋白的表达水平，CCK-8试验检测细胞增殖率，流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率； 3、实验二：将实验分为四组：空白对照（Control）组、二甲双胍(Metformin)组、AMPK下调+二甲双胍(AMPK/siRNA+Met)组、RIP140下调+二甲双胍(RIP140/siRNA+Met)组， Western blot检测细胞内 AMPK、P-AMPK、RIP140等蛋白的表达水平，CCK-8试验检测细胞增殖率，利用流式Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。 结果： 1、实验一结果： 1) Western blot结果显示：与Control组相比，AMPK/siRNA组的AMPK、P-AMPK、RIP140的表达均减少（P<0.01）；RIP140/siRNA组的仅有RIP140的表达减少（P<0.01）； 2) CCK-8结果显示：和Control组相比，AMPK/siRNA组和RIP140/siRNA组细胞增殖率均明显增加（P<0.01）； 3)流式Annexin V-FITC/PI结果显示：和Control组相比，AMPK/siRNA组、RIP140/siRNA组的细胞凋亡率均减少（P<0.05）。 2、实验二结果： 1) Western blot结果显示：(A)与Control组相比，Metformin组P-AMPK、RIP140的表达均增加（P<0.05）；(B)与Metformin组相比，AMPK/siRNA+Met组AMPK、P-AMPK及RIP140的表达均减少（P<0.01）；(C)与Metformin组相比，RIP140/siRNA+Met组RIP140的表达减少（P<0.01），而AMPK、P-AMPK的表达虽有所改变，但无统计学意义（P>0.05）。 2) CCK-8结果显示：(A)与Control组相比，Metformin组、RIP140/siRNA+Met组的细胞增殖率均明显减少（P<0.01），而AMPK/siRNA+Met组的增殖率虽有所减少，但不具有统计学意义；(B)和 Metformin组相比，AMPK/siRNA+Met组的增殖率明显增加（P<0.01），而RIP140/siRNA+Met组的增殖率虽有所增加，但不具有统计学意义（P>0.05）。 3)流式Annexin V-FITC/PI结果显示：(A)与Control组相比，其它三组的凋亡率均有不同程度增高（P＜0.05）,其中 Metformin组增高最明显；(B)与Metformin组相比， AMPK/siRNA+Met组的凋亡率显著降低（ P<0.01），而RIP140/siRNA+Met组的凋亡率稍有降低（P<0.01），且AMPK/siRNA+Met组下降较明显。 结论： 1、AMPK的下调、RIP140的下调均具有促肝癌细胞增殖、抑肝癌细胞凋亡的作用； 2、二甲双胍可激活AMPK，也使RIP140的表达上调。 本研究结果提示，二甲双胍可通过AMPK/RIP140信号通路发挥抗肝癌作用，为进一步研究提供基础。

目录

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验细胞

2.1.2 主要实验试剂

2.1.3 主要实验仪器、设备干式恒温仪

2.1.4 主要试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 RIP140-siRNA和AMPK-siRNA的合成

2.2.3 siRNA转染SMMC-7721细胞(以六孔板为例)

2.2.4 细胞干预及分组

2.2.5 Q-PCR检测各组目的蛋白的表达情况

2.2.6 Western Blot检测各组目的蛋白的表达情况

2.2.7 CCK-8法检测细胞增殖情况

2.2.8 Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞凋亡率

2.2.9 统计学方法

第3章 结果

3.1 最佳siRNA序列的筛选

3.1.1 筛选最佳AMPK 干扰siRNA序列

3.1.2 筛选最佳RIP140 干扰siRNA序列

3.2 AMPK下调、RIP140下调对人肝癌SMMC7721细胞系的影响

3.2.1 对细胞内AMPK、RIP140蛋白表达情况的影响

3.2.2 对细胞增殖的影响

3.2.3 对细胞凋亡的影响

3.3 AMPK、RIP140下调影响二甲双胍对人肝癌SMMC7721细胞的作用

3.3.1 影响二甲双胍作用于肝癌细胞后AMPK、RIP140蛋白表达

3.3.2 对二甲双胍抑制细胞增殖作用的影响

3.3.3 对二甲双胍促进细胞凋亡作用的影响

第4章 讨论

4.1糖尿病与肝癌的联系

4.2二甲双胍与肝癌的联系

4.3 RIP140与肝癌的联系

4.4 AMPK与RIP140的联系

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 糖尿病和二甲双胍在肝癌中的作用