江西特有植物突托蜡梅遗传多样性研究

摘要

突托蜡梅是江西特有的兼性克隆植物，现已被列为国家重点保护植物。本文从7个天然居群采集突托蜡梅样本，确定了从突托蜡梅叶片中制备模板DNA的最佳方法，优化了PCR循环参数，建立了ISSR—PCR扩增的最佳反应体系，筛选出扩增多态性片断较多且扩增产物稳定的引物，通过10条ISSR引物对213个突托蜡梅个体的基因组DNA进行扩增，对突托蜡梅居群的遗传结构和克隆多样性进行了研究。 研究结果表明，与CTAB法、SDS法、高盐低pH值法、SDS-CTAB法、SDS-蛋白酶K法相比，改良的CTAB法提取的DNA OD260/OD280值最好，浓度最高，是提取突托蜡梅基因组DNA的有效方法。ISSR扩增条件为：20μL PCR反应体系中，1×PCR缓冲液，2．0 U Taq DNA聚合酶，1．5 mmol/L MgCl2，0．6μmol/L引物，0．15 mmol/L dNTPs，50 ng模板DNA。最佳扩增反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50．8℃～58．3℃退火45 s，72℃延伸2 min，40个循环；最后在72℃延伸5 min。 共对100条ISSR引物进行了筛选，分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的10条ISSR引物用于7个居群DNA样本扩增，共扩增出74个位点，其中39个多态位点，多态性位点百分比为52．7％。 根据不同个体的扩增图构建了0、1矩阵（其中模糊带和弱带忽略不计）输入计算机。对ISSR数据处理结果如下：物种水平上，多态位点百分比P为52．7％，Nei's基因多样性指数H为0．1572，Shannon信息指数I为0．2408，平均克隆尺度Nc为1．1390，基因型比率PD为0．8780，Simple多样性指数D为0．998；居群水平上，多态位点百分比P为21．62％～41．8g％，Nei's基因多样性指数H为0．0958～0．1538，Shannon信息指数I为0．0946～0．2220，平均克隆尺度Nc为1．0000～1．2310，基因型比率PD为0．8620～1．0000，Simple多样性指数D为0．9840～1．0000，均匀度指数E为0．0000～0．7840，居群间的分化系数（Gst）为0．2489，AMOVA分析表明，26．37％的遗传变异存在于居群间，表明居群间有一定的遗传分化。Mantel检测表明地理距离和Nei's遗传距离间相关性显著（r=0．712，p<0．001）。由UPGMA聚类分析得知安远的4个居群聚为一支，会昌的3个居群聚为一支。 突托蜡梅表现出较低的遗传多样性和较高的遗传分化系数，这主要与该物种的繁育方式，基因流，遗传漂变等因素有关，高的克隆多样性表明突托蜡梅是以有性繁殖为主。遗传变异和克隆多样性的研究将为分析突托蜡梅致濒危原因及进化潜力提供重要资料，对该物种保护具有指导意义。

目录

文摘

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声明

引言

1文献综述

1.1遗传多样性概述

1.1.1遗传多样性及其研究意义

1.1.2遗传多样性产生的基础

1.1.3种群遗传结构

1.1.4遗传多样性的研究方法

1.1.5遗传多样性的研究进展

1.2克隆植物生态学研究

1.2.1克隆植物及其生态学研究的意义

1.2.2克隆植物种群生态学研究的主要内容

1.3 DNA分子标记技术中几种常用技术的基本概念和特点

1.3.1 ISSR标记技术

1.3.2 RAPD标记技术

1.3.3 SSR标记技术

1.3.4 AFLP标记技术

1.4 DNA分子标记技术在遗传学研究中的应用

1.4.1遗传多样性的检测

1.4.2分子标记在克隆鉴定中的应用

1.4.3品种亲缘关系及分类研究

1.4.4性别鉴定的研究

1.4.5种质鉴定及种质资源保护的研究

1.4.6构建分子标记遗传图谱及辅助树木育种的研究

1.5突托蜡梅的研究意义及其分布

1.6突托蜡梅当前的研究现状

2材料与方法

2.1 DNA的提取方法比较

2.1.1实验材料

2.1.2仪器与设备

2.1.3试剂和溶液

2.1.4 DNA提取方法

2.1.5基因组DNA琼脂糖凝较电泳的检测

2.1.6基因组DNA浓度测定和纯度检测

2.2 ISSR分子标记对突托蜡酶遗传多样性的分析

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器与试剂

2.2.3 ISSR最佳反应体系的建立及优化

2.2.4引物筛选

2.2.5 PCR扩增产物的电泳分析

2.2.6数据统计和分析

3结果与分析

3.1不同方法提取DNA质量和产量比较

3.2最佳ISSR反应体系的建立

3.2.1不同退火温度对ISSR扩增的影响

3.2.2模板DNA浓度对ISSR扩增的影响

3.2.3 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响

3.2.4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

3.2.5引物浓度对ISSR扩增的影响

3.2.6 Taq酶用量对ISSR扩增的影响

3.2.7循环次数对ISSR扩增的影响

3.3突托蜡梅引物的筛选

3.4突托蜡梅的ISSR遗传多样性分析

3.5突托蜡梅的ISSR遗传变异分析

3.6居群间遗传距离及聚类分析

3.7克隆多样性分析

4讨论

4.1 DNA的提取

4.2 PCR反应体系的建立和优化

4.3突托蜡梅的遗传多样性及遗传分化

4.4突托蜡梅的克隆多样性

4.5突托蜡梅的种群保护策略

5结论

参考文献

在学期间公开发表论文及著作情况

致谢