用分子标记研究蜡梅种质及山蜡梅复合体的遗传多样性

摘要

蜡梅属属于蜡梅科,是中国特有属,包含的物种数很少,具有中国特色的传统花灌木蜡梅以及极具开发潜力的山蜡梅均被包含在其中。近年来,虽然从宏观的形态分类到微观的化学成分、解剖学、细胞学及同工酶等方面对蜡梅属植物进行了大量的研究,但在DNA水平的研究报道很少,对该属物种遗传多样性的了解甚少。至今仍存在着2个问题没有得到很好的解决,一是蜡梅的品种分类,二是浙江蜡梅与突托蜡梅的分类处理。本研究正是围绕这2个问题,利用分子标记技术研究了蜡梅栽培种质的遗传多样性和山蜡梅复合体自然居群的遗传结构,期望从分子水平寻找解决问题的有力证据。
　　 主要的研究结果如下:
　　 1.76份蜡梅栽培种质(29份来自南京,47份来自武汉)的AFLP分析
　　 (1)8对引物总共扩增出了301条带,大小在150bp-550bp之间,其中165条为多态性带(多态率为54.82％),平均每对引物扩增出20.65条多态性带。其中,引物组合E-AAA/M-CAC扩增出的多态性带最多,有30条；引物组合E-ATA/M-CAC产生的多态性带最少,仅有7条。
　　 (2)76份蜡梅种质的Jaceard相似系数在0.69(H101和H38)与0.95(H8和H9)之间,平均值为0.80。南京蜡梅种质的Jaccard相似系数在0.73(N4和N23)与0.92(N37和N57)之间,平均值为0.82。武汉蜡梅种质的Jaccard相似系数在0.69(H101和H38)与0.95(H8和H9)之间,平均值为0.80。
　　 (3)UPGMA聚类图将76份蜡梅种质分成了7大类。蜡梅栽培种质的聚类与其地理来源有很密切的关系,来自武汉与南京2个地区的蜡梅分别聚类,没有出现交叉聚类的现象。主坐标分析的结果也显示来自武汉的蜡梅种质与来自南京的蜡梅种质呈明显的分离趋势。这表明南京与武汉的蜡梅种质之间存在着一定的遗传分化。
　　 (4)蜡梅的花色、花的大小、花期及花型等表型特征在聚类图中没有明显的分布规律。
　　 (5)76份蜡梅种质资源的h与I值分别为0.1563、0.2392,表明蜡梅的栽培种质具有较高的遗传多样性。武汉蜡梅群体的PPL、h及I值(依次为52.49％、0.1582、0.2393)均高于南京蜡梅群体的相应值(依次为39.53％、0.1275、0.1920),表明武汉蜡梅种质的遗传多样性比南京的高。
　　 (6)南京与武汉2个蜡梅栽培群体的AMOVA分析表明,绝大部分的遗传变异
　　 (86.60％)来自于群体内部,并且南京蜡梅群体与武汉蜡梅群体间存在着极显著差异(ΦST=0.134,P＜0.001；Bp=0.1729,P＜0.001)。
　　 导致南京与武汉的栽培种质间发生遗传分化的可能因为是:其一,与蜡梅的交配体系(以异交为主,靠昆虫传粉)和育种方式(实生苗繁殖、自然选择育种)有关；其二,两地的育种者根据当地审美观念的不同而采用了不同的选择标准,即对蜡梅自然变异的选择和利用标准不一样;其三,在最初育种时,两地所选的种源有差异,而在以后的育种中,两地在育种材料上缺乏交流。因此,在今后的蜡梅育种中,不同的栽培区应加强相互引种,或者直接从还处于野生状态的自然分布区引种,积极开展种质问的交流,充分利用和开发稀有的种质资源。另外,应将传统的自然选择育种与杂交育种、人工诱变育种及分子标记辅助育种相结合,培育出更优的品种,为蜡梅的切花、盆栽等产业服务。
　　 2.7个山蜡梅复合体自然居群遗传结构的ISSR分析
　　 (1)选出的12条引物总共扩增出了142条带,大小在300bp-2800bp之间,其中134条为多态性带(多态率为94.37％),平均每个引物扩增出11.17条多态性带。其中,ISR4与ISR20都扩增出了18条多态性带；ISR14与ISR21扩增出的多态性带比较少,都只有7条。
　　 (2)山蜡梅复合体的PPL、h与I分别为94.37％、0.2776、0.4207,表现出丰富的遗传多样性。在居群水平,PPL为39.44％-59.15％,平均值为48.59％;h为0.1239-0.1893,平均值为0.1571；I为0.1878-0.2866,平均值为0.2373。PPL、h与I对7个居群的分析结果是完全一致的,按照遗传多样性由高到低的顺序,7个居群依次排列为FJWYS＞ZJLQ＞JXAY＞GLYS＞HNJH＞HNXN＞ZJTS。
　　 (3)AMOVA分析表明,居群内的遗传变异与居群间的遗传变异分别为49.65％、50.35％,并且其变异程度达到了极显著水平(p＜0.001)。将7个自然居群分成3个组(GLYS+HNJH+HNXN,JXAY,FJWYS+ZJLQ+ZJTS),进行嵌套式分子变异分析,发现来自居群内、组间、及组内居群间的遗传变异分别为44.98％、33.36％、21.66％,如果只考虑组间与组内2个水平,组间与组内的遗传变异分别为43.06％、56.94％。分子变异分析的结果表明在山蜡梅地理居群间存在明显的遗传分化,而每个居群内部存在着丰富的遗传变异。
　　 (4)山蜡梅复合体自然居群的Gst为0.4334,表明在山蜡梅复合体的自然居群间存在着极强的遗传分化趋势。GLYS、HNJH及HNXN3个相邻居群间的Gst为0.2365,FJWYS、ZJLQ及ZJTS3个相邻居群间的Gst为0.2460,表明山蜡梅复合体居群间的遗传分化与居群间的地理距离有关,地理距离越小,居群间的遗传分化程度越低,但是即使在相邻的居群间,仍然存在着比较大的遗传分化。
　　 (5)山蜡梅复合体的基因流Nm=0.6537,表明由于长距离的地理隔离,居群间发生基因交流的频率很低。阳朔(GLYS)、江华(HNJH)和新宁(HNXN)3个居群间的基因流Nm=1.6141；武夷山(FJWYS)、龙泉(ZJLQ)和泰顺(ZJTS)3个居群间的基因流Nm=1.5325,这表明基因流在居群间的流动情况与地理距离有关,在相邻的居群间,有基因交流的发生。正是由于有基因交流的发生,使得相邻居群间的遗传一致度相对较高,遗传分化程度相对较低。
　　 (6)GLYS与HNJH的遗传一致度最高(0.9294),遗传距离最小(0.0733),GLYS与ZJTS间的遗传一致度最小(0.7631),遗传距离最大(0.2703)。GLYS、HNJH及HNXN3个居群间的遗传一致度很高(均在0.91以上),遗传距离很小(均小于0.1)。FJWYS、ZJLQ及ZJTS3个居群间的遗传一致度也很高(0.8830-0.9205之间),遗传距离也相对较小(0.0829-0.1245之间)。
　　 (7)根据遗传距离构建的居群LPGMA聚类图(图8),根据Jaccard相似系数构建的个体UPGMA聚类图(图6),以及主坐标分析(图7)3种聚类的结果完全一致,7个居群按照地理位置的远近明显地聚成3类,即GLXS、HNJH与HNXN3个居群构成1类,居群JXAY独自成1类,FJWYS、ZJLQ与ZJTS3个居群聚成1类。
　　 (8)遗传距离与地理距离的Mantel检验,r=0.7744(P＜0.001),表明山蜡梅复合体自然居群间的遗传距离与其地理距离间具有弱相关性。
　　 (9)通过分析居群的形态变异及遗传结构,认为浙江蜡梅与突托蜡梅以新种成立欠妥,应归并到山蜡梅中。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 文献综述

1.1 遗传多样性的含义及研究方法

1.1.1 遗传多样性的含义

1.1.2 研究遗传多样性的方法

1.2 蜡梅科植物的系统分类、生物学及应用研究进展

1.2.1 蜡梅科属的分类及演化关系

1.2.2 蜡梅科种的分类与系统学研究

1.2.3 蜡梅属植物的研究进展

1.2.4 蜡梅属植物在园林应用与经济生产中的利用现状及潜力

1.2.5 蜡梅属植物在目前研究中急需解决的问题

1.3 本研究的目的、意义及研究的内容

1.3.1 研究的意义

1.3.2 研究的目的与内容

2 利用AFLP标记分析蜡梅科种间亲缘关系及蜡梅种质的遗传多样性

2.1 实验材料

2.2 主要仪器设备和试剂

2.2.1 主要的仪器设备

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要溶液配制

2.3 实验方法

2.3.1 叶片基因组DNA的提取

2.3.2 AFLP分析

2.3.3 数据分析

2.4 结果与分析

2.4.1 优化的反应体系

2.4.2 引物的筛选及多态性

2.4.3 聚类分析

2.4.4 主坐标分析

2.4.5 武汉与南京栽培群体间的遗传关系

2.5 讨论

2.5.1 蜡梅栽培种质的遗传多样性分析

2.5.2 种间亲缘关系的初步分析

2.5.3 对蜡梅种质资源利用、育种及产业化发展的指导

2.5.4 AFLP标记带谱质量的影响因素分析

2.5.5 银染AFLP标记在本实验中的分析效果评价

3 用ISSR标记研究山蜡梅复合体自然居群的遗传多样性

3.1 实验材料

3.1.1 材料的来源

3.1.2 材料的采集

3.2 主要的仪器设备和试剂

3.3 实验方法

3.3.1 叶片总DNA的提取

3.3.2 ISSR分析

3.3.3 数据分析

3.4 结果与分析

3.4.1 优化的ISSR反应体系

3.4.2 引物的筛选及多态性

3.4.3 居群内的遗传多样性分析

3.4.4 个体间的遗传相似系数及系统聚类分析

3.4.5 居群的遗传结构

3.4.6 居群组的遗传遗传多样性分析

3.4.7 遗传距离与地理距离的相关性分析

3.5 讨论

3.5.1 ISSR引物序列

3.5.2 山蜡梅复合体的遗传多样性

3.5.3 从居群角度论浙江蜡梅与突托蜡梅的分类

3.5.4 山蜡梅遗传多样性与其保护生物学意义

3.5.5 山蜡梅遗传多样性与其遗传育种

4 本论文的创新点

参考文献

致谢

附录

附录1 部分蜡梅种质的图板及说明

附录2 山蜡梅不同居群样本的图板及说明

附录3 AFLP标记的电泳图谱

附录4 ISSR标记的电泳图谱

发表及拟发表的文章