犬细小病毒VP2基因的分子生物学特性的研究

摘要

犬细小病毒(Canine Parvovirus CPV)的VP2基因编码主要衣壳蛋白,VP2基因在犬细小病毒感染过程中起着极为重要的作用,其编码CPV的主要抗原决定簇,可诱导机体产生中和抗体.根据基因库中犬细小病毒基因序列设计合成了一对引物,其两端分别含Eco和RISall酶切位点,从犬细小病毒扬州分离株提取基因组DNA,并以此为模板,进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出VP2基因的1740bp的扩增产物,将PCR产物克隆进pUC18载体,并转化大肠杆菌TG<,1>,通过LacZ基因的插入失活,初步筛选出重组质粒.通过限制性内切酶分析,得到CPV VP2阳性重组质粒.对该分离株的VP2基因进行序列测定,结果表明:所扩增基因片段长度为1740bp,同美国参考株CPV-d(type 2)、CPV-15(type 2a)、CPV-39(type 2b)比较,核苷酸同源性分别高达99.5％、99.7％、99.7％,氨基酸同源性分别高达99.0％、99.7％、99.7％,表明VP2基因变异相对较少.为探讨VP2蛋白的生物学特性,该研究还设计合成了另两对引物,其两端分别含EcoRI和SalI酶切位点,以扬州分离株病毒DNA为模板,扩增了VP2基因的5′端和3′端大小为794bp、1041bp的两个片段.将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性载体pGEX-6P-1中的谷胱甘肽-S-转移酶下游,获得的重组质粒在1.0mM IPTG和37℃条件下诱导,通过对重组大肠杆菌裂解物的SDS-PAGE电泳分析,鉴定出两条分子量分别为54kD和61kD表达条带.将表达产物从SDS-PAGE凝胶中切出回收,并用其免疫6-8周龄ICR小鼠,每周免疫一次,5次免疫后,采血分离血清,所得抗血清与犬细小病毒扬州分离株感染的胎猫肾细胞(FK81)进行间接免疫荧光试验(IFA),呈现特异性荧光,表明大肠杆菌表达的VP2基因产物保留了天然VP2蛋白的抗原性.该研究对CPV扬州分离株的VP2基因序列分析,为探索CPV抗原漂变奠定了基础;而借助于大肠杆菌表达系统制备VP2的融合蛋白,为进一步研制VP2蛋白特异单抗及筛选CPV基因工程苗创造了条件.

目录

文摘

英文文摘

一、符号说明

二、文献综述

三、研究内容

第一章犬细小病毒扬州分离株VP2基因的克隆和序列分析

1材料和方法

2结果

3.讨论

附录

第二章犬细小病毒扬州分离株VP2基因的克隆和表达

四、参考文献

五、附 录

六、致 谢