犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析

摘要

犬瘟热(Canine Distemper, CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distempervirus，CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)引起的以肠炎、腹泻与主的烈性传染病。为了更好的控制与预防上述两种疫病的流行，本研究开展了犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析。
　　首先，本研究以CDV3的RNA为模板，原核表达纯化了带His标签的N蛋白截短片段(aa277-471)，免疫BALB/c雌鼠后，将其B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过包被N蛋白截短片段(aa277-471)的ELISA筛选，获得分泌抗CDV的单克隆抗体杂交瘤阳性细胞1株，命名为1N8，亚类鉴定为IgG1a，kappa链，该单克隆抗体间接免疫荧光检测阳性、WB检测阳性。
　　接下来采用噬菌体展示和肽扫描的方法，筛选1N8结合的抗原表位:合成N蛋白(aa277-471)的15肽文库，每条多肽长度15aa，位移5aa，通过结合和筛选，得到一条与单克隆抗体1N8阳性反应的多肽，通过多肽N端和C端的不断缩减，最终证明该抗原表位的最小识别单位:351NFGRSYFDp359。通过3D模拟，发现此表位位于N蛋白的外侧，其与CDV阳性血清具备一定的ELISA反应能力。通过比对，其与CDV同属麻疹病毒、牛瘟病毒，小反刍兽疫病毒一致，并对小反刍兽疫病毒进行了WB验证，其结果为阳性。
　　以杂交瘤细胞1N8为模板，分离出抗体轻链和重链可变区，通过基因工程的方式组装成单链抗体，通过原核表达，获得了重组1N8单链抗体蛋白，经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测，其具备1N8单抗的部分活性。
　　以腺病毒为表达载体，研究了351NFGRSYFDp359表位疫苗的免疫效力:构建含351NFGRSYFDp359表位和肠炎细小病毒VP2基因的表达盒，通过PCR和WB检测，重组腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表达出外源片段。小鼠免疫试验显示:与商品化对照疫苗相比，重组腺病毒的CPV的ELISA效价与之相当，但CDV的ELISA效价比较低。
　　最后，在本研究开展了CPV VP2基因遗传变异研究:历经4年，收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份，分离病毒8株，获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份，其中CPV-2a型20份，CPV-2b型2份，测序结果显示我国CPV存在CPV-2a(Ser297Ala)变异，而且CPV VP2基因序列相似度为99.3-99.9％，系统发育树证明本次分离的大多数CPV毒株为一个大的分支中，与泰国KU143-09株类似，且不呈现地域相关性。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 犬瘟热病毒

1．1．1 犬瘟热病毒病原学

1．1．2 犬瘟热病毒基因组及N蛋白研究进展

1．2 犬瘟热病毒单克隆抗体的研究

1．2．1 犬瘟热病毒单克隆抗体的制备

1．2．2 犬瘟热病毒B细胞表位

1．2．3 犬瘟热病毒单链抗体

1．3 犬瘟热病毒诊断技术研究

1．3．1 犬瘟热病毒病原学诊断

1．3．2 犬瘟热病毒血清学诊断

1．4犬瘟热病毒疫苗研究进展

1．4．1 犬瘟热病毒毒株及疫苗

1．4．2 犬瘟热病毒新型疫苗

1．4．3 犬瘟热病毒免疫失败原因

1．5 腺病毒作为载体在动物疫苗中的研究进展

1．6 肉食动物细小病毒

1．6．1 肉食动物细小病毒概述

1．6．2 基因组特征

1．6．3 犬细小病毒

1．6．4 犬细小病毒变异和VP2蛋白氨基酸突变

1．6．5 我国犬细小病毒流行状况

1．7 研究的目的和意义

第二章 CDV N蛋白单克隆抗体的制备

2．1 材料与方法

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 毒株及实验动物

2．1．3 主要仪器和耗材

2．1．4 N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR

2．1．5 N蛋白截短蛋白(aa277-471)表达载体构建

2．1．6 pEASY-N表达菌株诱导表达

2．1．7 重组CDV-N蛋白表达预处理

2．1．8 N蛋白表达Ni-NTA纯化

2．1．9 N蛋白SDS-PAGE分析

2．1．10 CDV-N蛋白免疫程序

2．1．11 N蛋白间接ELISA检测方法的建立

2．1．12 细胞融合试验

2．1．13 阳性杂交瘤细胞的筛选

2．1．14 MAbs腹水的制备

2．1．15 间接免疫荧光(IFA)鉴定

2．1．16 MAb的Western blot鉴定

2．1．17 MAb上清与腹水效价测定以及亚类鉴定

2．1．18 MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联

2．2 结果

2．2．1 N基因的PCR扩增

2．2．2 重组供体质粒pEASY-N的鉴定

2．2．3 pEASY-N重组质粒的表达与纯化

2．2．4 间接ELISA检测法的建立

2．2．5 阳性杂交瘤细胞株的获得

2．2．6 MAb上清与腹水效价测定以及亚型鉴定

2．2．7 MAb的IFA鉴定

2．2．8 MAb的Western blot鉴定

2．2．9 MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联

2．3 讨论

2．3．1 CDV单克隆抗体的制备

2．3．2 选择CDV N蛋白的原因

2．3．3 CDV单克隆抗体国内外应用进展

第三章 筛选犬瘟热病毒N蛋白(aa 277-471)B细胞表位

3．1 材料与方法

3．1．1 主要实验试剂

3．1．2 单克隆抗体1N8的纯化

3．1．3 噬菌体筛选与扩增

3．1．4 阳性噬菌体序列测定

3．1．5 犬瘟热病毒N蛋白(aa277-471)合成肽的制备

3．1．6 抗原表位的初步鉴定(肽扫描)

3．1．7 抗原表位的精确鉴定

3．1．8 抗原表位的特异性鉴定

3．1．9 抗原表位合成多肽与CDV阳性／阴性血清ELISA反应

3．1．10 抗原表位的3D位置

3．2 实验结果

3．2．1 单抗腹水纯化

3．2．2 肽库淘选

3．2．3 随机噬菌体的测序结果

3．2．4 肽扫描结果

3．2．5 抗原表位的精确鉴定

3．2．6 抗原表位的比对

3．2．7 1N8与小反刍兽疫病毒的WB检验

3．2．8 抗原表位351NFGRSYFDP359在N蛋白中的3D位置

3．2．9 抗原表位351NFGRSYFDP359与CDV阳性血清反应能力

3．3 讨论

3．3．1 CDV N蛋白B细胞抗原表位

3．3．2 麻疹病毒属N蛋白抗原表位分析

第四章 基于杂交瘤细胞1N8的单链抗体制备与鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 细胞与菌株

4．1．2 主要实验试剂

4．1．3 引物设计

4．1．4 杂交瘤的RNA提取，cDNA合成和基因扩增

4．1．5 单链抗体scFv／1N8 gene的合成

4．1．6 原核表达重组质粒的构建

4．1．7 单链抗体基因的序列比对分析

4．1．8 单链抗体的表达

4．1．9 重组蛋白的纯化

4．1．10 重组蛋白的复性

4．1．11 蛋白浓度的测定

4．1．12 单链抗体活性检测

4．2 结果

4．2．1 scFv／1N8 gene基因的扩增结果

4．2．2 scFv／1N8 gene基因的序列分析

4．2．3 scFv／1N8重组蛋白的表达与纯化

4．2．4 scFv／1N8重组蛋白的活性检测

4．3 讨论

4．3．1 CDV单链抗体的研究

4．3．2 CDV单链抗体的构建方式

4．3．3 CDV不同蛋白单链抗体的未来展望

第五章 CDV351NFGRSYFDP359表位疫苗研究

5．1 材料与方法

5．1．1 腺病毒表达载体和试剂

5．1．2 含目的基因(表位+VP2)的PCR扩增

5．1．3 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建

5．1．4 重组腺病毒载体菌内重组鉴定

5．1．5 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞

5．1．6 重组腺病毒滴度(TCID50)的滴定

5．1．7 重组腺病毒的形态学观察

5．1．8 重组腺病毒的PCR鉴定

5．1．9 重组腺病毒的WB鉴定

5．1．10 重组病毒免疫小鼠实验

5．2 结果

5．2．1 PCR扩增结果

5．2．2 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建结果

5．2．3 重组腺病毒的包装

5．2．4 重组病毒滴度(TCID50)的测定

5．2．5 重组腺病毒的电镜观察

5．2．6 重组腺病毒的VP2基因PCR结果

5．2．7 重组腺病毒的Western blot检测

5．2．8 重组腺病毒免疫小鼠后CPV抗体效价

5．2．9 重组腺病毒免疫小鼠后CDV抗体效价

5．3 讨论

5．3．1 腺病毒载体的优势

5．3．2 CPV VP2基因的VLP特征

5．3．3 CDV表位疫苗

第六章 犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析

6．1 材料与方法

6．1．1 菌株、载体和试剂

6．1．2 CPV基因组提取方法

6．1．3 用于CPV毒株遗传进化分析的毒株信息

6．1．4 CPV PCR扩增

6．1．5 CPV特异性片段的PCR扩增与RFLP分析

6．1．6 CPV VP2基因的克隆

6．1．7 利用实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV病毒含量

6．1．8 犬细小病毒分离

6．1．9 犬细小病毒系统发育树的构建

6．2 试验结果

6．2．1 样品中细小病毒的常规PCR鉴定

6．2．2 犬细小病毒RFLP分析

5．2．3 犬细小病毒病毒分离

6．2．4 犬细小病毒VP2基因的克隆

6．2．5 实时荧光定量PCR相对定量方法测定细小病毒载量

6．2．6 犬细小病毒VP2基因的序列分析

5．2．7 犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变

6．2．8 CPV VP2基因系统发育树分析

6．3 讨论

6．3．1 我国CPV流行趋势分析

6．3．2 VP2蛋白氨基酸变异分析

6．3．3 我国CPV免疫保护分析

6．3．4 CPV及其他犬科动物感染细小病毒联系

第六章 全文结论

附录

参考文献

致谢

作者简历