减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207asd基因突变株的构建及其生物学特性

摘要

鼠伤寒沙门氏菌(St)是一种肠道致病菌，它是一种胞内侵袭性细菌。利用侵袭性胞内细菌作为载体传递外源抗原基因疫苗是目前基因免疫研究的热点之一[67]。它可将质粒DNA直接呈递给抗原提呈细胞(APC)，携带质粒DNA的细菌在APC细胞内发生溶解或以宿主吞噬小体为桥梁进入胞质，并将DNA释放到细胞核，使抗原基因在体内进行表达而诱导相应的细胞免疫和体液免疫反应。通过各种方法减毒的沙门氏菌，虽然失去了对动物的致病性，但不影响其在体内的繁殖和侵袭能力。SL7207是其中的一种，它是由一个基因，即aroA基因的突变构建的减毒株。SL7207因其aroA基因的突变，自身不能合成需要的芳香族氨基酸，必须从外界获取芳香族氨基酸才能生长，而哺乳动物体内不含有该类氨基酸，使得SL7207在哺乳动物体内生长受限，从而达到了减毒的目的。 减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207是DNA疫苗常用的载体工程菌，asd(asparticsemialdehydedehydrogenase)基因所编码的天冬氨酸半醛脱氢酶，是细菌赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸(diaminopimelicacid，DAP)合成途径中的一种关键酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要成分。当asd基因发生突变时，细菌不能自行合成DAP，菌体就融解死亡，所以其生长依赖DAP的外部加入。本研究通过同源重组的方式，构建了鼠伤寒沙门氏菌SL7207asd基因突变株SL7207(asd-)，并通过比较SL7207与SL7207(asd-)在体内、体外的生长、增殖情况，对SL7207(asd-)的部分生物学特性进行研究。 1减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207asd基因突变株的构建与鉴定为构建asd基因突变株，首先采用PCR的方式，从减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207的染色体上扩增了asd基因上游561bp序列，其中包括asd基因5’端的61bp的上游序列，asd基因下游的837bp序列，其中包括337bp的asd基因3’端序列。将这两个片段连接后，以连接产物作为模板，PCR扩增出asd基因缺失的同源核苷酸片段，将这个片段克隆到pMDl8-T载体上，对这个片段进行核苷酸序列的测定，然后将这个片段从pMDl8-T载体上用BamHI限制性内切酶切下，把这个片段克隆到自杀质粒pGMBl5l上，转化感受态细胞SPY372λpir，利用抗性固体培养基筛选正确连接的阳性菌株，扩增该质粒，将这个质粒电转化进SL7207中进行同源重组，采用PCR方式观察重组现象，筛选稳定的突变株。本研究通过上述方式筛选到了一株asd基因缺失的SL7207菌株，但是，它在没有添加DAP的普通LB培养基上也可以生长，其生物学特性与SL7207原株有很大的不同。 2减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207asd基因突变株SL7207(asd-)的生物学特性利用同源重组获得的鼠伤寒沙门氏菌SL7207asd基因突变株SL7207(asd-)，在生物学特性上与原始鼠伤寒沙门氏菌SL7207菌株有很大的不同，在普通LB培养基中，生长速度明显减慢；在普通LB中添加了DAP和赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸后SL7207(asd-)生长速度接近普通SL7207。该突变株在MDCK上皮细胞中的侵袭和增殖能力很弱，在RAW264.7巨噬细胞中，初期的侵袭力与普通SL7207接近，但在巨噬细胞中的生存和增殖能力明显减弱。小鼠口服接种感染细菌实验结果显示，SL7207(asd-)在ICR小鼠体内生存能力比SL7207下降许多(P＜0.05)，对肝脏和脾脏的侵袭力也下降许多。同时，被机体清除的时间缩短，诱导产生抗体应答水平显著低于SL7207(P＜0.05)。 减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207asd基因突变株的获得，不仅为沙门氏菌疫苗载体的优化提供了新材料和新思路，而且为染色体重组表达外源基因提供了可能的新靶点。本研究结果还提示，asd基因的结构和功能值得进一步深入研究。

目录

符号说明

文献综述 构建细菌基因突变株方法的研究进展

第一章 减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207 asd基因突变株

第二章减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207 asd基因突变株SL7207(asd-)的生物学特性

参考文献

附录

致谢