新城疫病毒融合蛋白高效表达及其特异性单克隆抗体的研制和初步应用

摘要

用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)标准强毒株F48E8扩增出融合蛋白(F)基因，并将其克隆到pGEM-T载体，命名为pGEM-NDF。经测序正确后，以BamHI和 XbaⅠ双酶切将F基因从pGEM-NDF中切下并插入到杆状病毒转移载体pFastBacl中，得到重组转移载体pFastBacl-NDF；将该载体转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选出重组穿梭质粒rBacmid-NDF，并转染Sf9昆虫细胞，获得了重组杆状病毒reBac-NDF；间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果表明，新城疫病毒F48E8株F蛋白在昆虫细胞中获得高效表达。 以重组杆状病毒reBac-NDF感染昆虫细胞72-96hr，收获细胞，腹腔免疫BalB/c小鼠。取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，用感染了NDV F48E8株的CEF进行IFA检测杂交瘤细胞上清，筛选出5株分泌抗NDV F蛋白的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为NDV-F1D10、NDV-F2F12、NDV-F4D9、NDV-F6C4、NDV-F5C6；经过亚克隆后，所有杂交瘤细胞均保持了分泌抗体的能力；效价测定结果表明，单抗腹水IFA效价分别为1:1600、1:1600、1:1600、1:3200、1:800；IFA显示五株单克隆抗体能与野鸭源NDV和Lasota株感染的CEF反应，均不与MDV、REV、IBDV感染的CEF反应，证明所得的五株单抗是针对NDV F蛋白的特异性单抗，抗NDV F蛋白单抗的获得为NDV F蛋白的相关研究提供了良好的材料。 用五株抗NDV F蛋白的单抗检测两种重组MDV CV1988转移载体质粒pucUS10-NDF和pucUS10-eGFP-IRES-F转染COS-1细胞，结果5株单抗中有两株单抗NDV-F1D10和NDV-F2F12 IFA在IFA中呈现亮绿色荧光，表明单抗NDV-F1D10和NDV-F2F12能识别COS-1上暂态表达的F蛋白，可以用于表达F蛋白基因工程苗的检测。

目录

论文说明：符号说明

综述

研究内容一：新城疫病毒融合蛋白基因的高效表达

1.材料

2.方法

3 结果

4.讨论

研究内容二：抗新城疫病毒融合蛋白特异单克隆抗体的研制及其特性

1.材料

2 方法

3 结果

4.讨论

研究内容三：抗新城疫病毒融合蛋白单克隆抗体的初步应用

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

参考文献

成果小结

致谢