鸡源呼肠孤病毒的分离、鉴定及其σC蛋白的原核表达和单克隆抗体的研制

摘要

用SPF鸡胚接种分离法分离病毒，通过形态学、致细胞病变和序列比较等对分离的病毒进行分析鉴定，结果从鸡病料中分离到一株疑似呼肠孤病毒。通过透射电镜观察发现该病毒粒子为球形、无囊膜，大小为70nm左右；该病毒不具有凝集鸡红细胞的能力，但在鸡胚成纤维细胞(CEF)上可致细胞融合，折光性增强等病变。利用Trizol LS试剂直接从感染鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，并根据NCBI发表的基因序列，设计引物，采用RT-PCR方法，成功扩增获得了σC基因片段，将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定，并与禽(鸡)呼肠孤病毒标准株基因组的相应序列比较，结果表明，本研究成功扩增出了完整的σC基因的开放阅读框架，且分离株与禽(鸡)呼肠孤病毒在基因序列上同源性很高，其中与ARV S1133的同源性高达99％。这些结果证明，分离到的病毒为禽呼肠孤病毒，命名为ARV-SZ。 将禽呼肠孤病毒外壳蛋白基因(σC)用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ从T载体质粒上双酶切，回收后，克隆到表达载体pGEX-6P-1，获得重组质粒pGEX-6P-σC，将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受念细胞，在含AMP、IPTG和X-gal的LB平板上筛选白色菌落，提取质粒DNA，经双酶切鉴定出含插入片段的阳性重组质粒后，阳性菌按1:100比例接种2mL LB液体培养基，37℃过夜培养，再以1:100比例接种10mL2×YT液体培养基，37℃200rpm摇3 h后，加0.5mM IPTG；诱导5 h后，终止培养。用抗ARV多抗对表达的蛋白进行Western-blot分析，结果获得与预期大小相同的条带，证明σC蛋白得到了良好的表达。用初步纯化的病毒免疫8周龄雄性Balb/c小鼠，0.3mL/只，每隔10d免疫一次。加强免疫3d后，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆，并经有限稀释法3次亚克隆后，获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株ARV-aC-588。间接ELISA试验进一步表明，该株单克隆抗体能与试验的ARV病毒发生特异性反应，而不能与小鹅瘟病毒(GPV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、新城疫病毒(NDV)等反应，研究结果证明该单抗是针对ARV σC蛋白的特异性单抗。这种特异性单抗为ARV的快速检测及σC蛋白功能的相关研究奠定了基础。

目录

论文说明：符号说明

文献综述

研究内容：研究一 禽呼肠孤病毒的分离与鉴定

1、材料

2、方法

3、结果

4、讨论

研究内容：研究二 禽呼肠孤病毒δC基因的克隆与原核表达

1、材料

2、方法

3、结果

4、讨论

研究内容：研究三 抗禽呼肠孤病毒δC单克隆抗体的研制及其部分特性

1、材料

2、方法

3、结果

4、讨论

研究成果

参考文献

致谢