金雀异黄素和腺病毒介导的细胞基因疗法抗肿瘤生长和转移的实验研究

摘要

目的： 1.研究金雀异黄素(Genistein，Gen)对人胃腺癌SGC7901细胞增殖、迁移以及与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)粘附的影响，并探讨其可能的作用机制。 2.探讨联合应用腺病毒介导的人TIMP-1和内皮抑素(Endostain，End)导入和细胞移植技术治疗或抑制小鼠黑色素瘤的生长和转移的可行性。通过感染表达人TIMP-1和End的重组腺病毒的小鼠原代成纤维细胞，研究原代成纤维细胞分泌的TIMP-1和End对小鼠黑色素瘤细胞迁移和浸润的影响；通过皮下接种感染腺病毒的原代成纤维细胞制剂，研究其对小鼠移植瘤的生长以及肿瘤转移的影响。 方法： 1.分别利用细胞计数和MTT方法检测Gen对SGC7901.细胞增殖的影响。 2.利用细胞划痕实验检测Gen对SGC7901细胞迁移的影响；利用细胞划痕实验和Transwell细胞浸润实验检测感染表达TIMP-1和End腺病毒后的原代成纤维细胞培养上清对小鼠黑色素瘤B16BL6 细胞迁移和浸润的影响。 3.利用肿瘤细胞与HuVECs粘附实验分别研究Gen对SGC7901细胞与单层HUVECs粘附的影响，以及感染表达TIMP-1和End腺病毒后的小鼠原代成纤维细胞培养上清对小鼠黑色素瘤B16BL6石细胞与HUVECs粘附的影响。 4.利用免疫荧光实验观察Gen对SGC7901细胞中E-cadherin、B-catenin和F-actin分布的影响；利用Western blotting检测了Gen对SGC7901细胞中FAK、p-FAK、E-cadherin和B-catenin蛋白表达水平的影响。 5.利用间接ELISA方法分别检测感染Ad-End和Ad-TIMP-1的原代成纤维细胞培养上清中以及原代成纤维细胞接种小鼠体内后的小鼠血清中TIMP-1和End的水平。 6.通过建立小鼠移植瘤模型，导入表达并分泌TIMP-1和End的原代成纤维细胞制剂，观察原代成纤维细胞分泌的TIMP-1和End对小鼠黑色素瘤生长的影响，重点研究联合感染Ad-TIMP-1和Ad-End的原代成纤维细胞制剂对移植瘤的生长的影响；利用细胞化学方法检测肿瘤组织病理学变化。 7.建立小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型，通过尾静脉注射B16BL6细胞，24 h后接种感染腺病毒的原代成纤维细胞制剂，3周后，处死小鼠观察肺转移灶或转移结节的变化。 结果： 1.细胞计数和MTT结果显示，与对照组相比，Gcn可以抑制SGC7901细胞的增殖，以7.5μmol/L对SGC7901细胞抑制效果最明显。 2.细胞划痕迁移实验结果显示，Gen以剂量依赖的方式抑制SGC7901细胞的迁移。细胞划痕实验和Transwell细胞浸润实验结果表明，与Mock组相比，Ad-TIMP-1和Ad-End感染组的细胞培养上清可以显著抑制小鼠黑色素瘤B16BL6细胞的迁移和浸润(P<0.05)，尤以Ad-TIMP-1+Ad-End联合感染组的细胞培养上清的抑制作用最为明显(P<0.01)。 3.肿瘤细胞与HUVECs粘附实验结果表明，Gen低剂量组(2.5μmol/L)不影响SGC7901细胞与单层HUVECs的粘附(P>0.05)，而5.0/μmol/L、7.5μmol/L和10.0μmol/L三个剂量组与对照组相比均可以显著地降低SGC7901细胞与单层HUVECs的粘附能力(P<0.01)。有趣的是，当Gen浓度达到20.0 μmol/L时，SGC7901细胞与HUVECs的粘附与对照组相比又无显著性差异(P>0.05)。感染腺病毒的原代成纤维细胞培养上清对B16BL6细胞粘附影响的实验结果显示，与Mock组和Ad-GFP组相比，Ad-TIMP-1组的细胞培养上清可以显著抑制B16BL6与单层HUVECs的粘附(P<0.05)，而Ad-End组和Ad-TIMP-1+Ad-End组与Mock和Ad-GFP组相比，细胞培养上清均可以显著地抑制B16BL6细胞与HUVECs的粘附(P<0.01)。 4.免疫荧光实验结果表明，7.5μmol/L的Gen可以引起SGC7901细胞中E-cadhcrin、B-catenin和actin重分布。Gen处理的紧密接触(相对静止的)的SGC7901细胞中应力纤维数目与对照组相比明显减少。Western Blotting结果显示，与对照组相比，不同浓度的Gen对SGC7901细胞中FAK和B-catenin的表达没有明显影响，但可以下调细胞中p-FAK和E-cadherin的表达。但是，当Gen的浓度为10.0μmol/L时，E-cadherin表达量又明显升高。 5.感染腺病毒的原代成纤维细胞培养上清的ELISA检测结果显示，随着感染Ad-End和Ad-TIMP-1的成纤维细胞在体外培养时间延长，End和TIMP-1的分泌逐渐增多，证实Ad-End和Ad-TIMP-1感染小鼠原代成纤维细胞后，感染细胞能有效表达并分泌End和TIMP-1至细胞培养上清中。在空白对照组(Mock)和空载腺病毒(Ad-GFP)组小鼠血清中未检测出人End和TIMP-1蛋白。感染Ad-End和Ad-TIMP-1的原代成纤维细胞制剂治疗组24 h的小鼠血清中就可检测出End和TIMP-1蛋白，并且随着时间的推移，小鼠血清中End和TIMP-1一直维持在较高水平，证实Ad-End和Ad-TIMP-1感染小鼠原代成纤维细胞后，在小鼠体内能有效表达并分泌TIMP-1和End蛋白。 6.与Mock和Ad-GFP组相比，感染Ad-End、Ad-TIMP-1后的小鼠原代成纤维细胞制剂治疗组可以抑制小鼠黑色素瘤B16BL6细胞移植痛的生长，尤其是，联合感染Ad-End和Ad-TIMP-1的原代成纤维细胞制剂治疗组对移植瘤的生长抑制具有明显的协同和累加效应(P<0.01)。组织病理学检测结果显示，感染Ad-End、Ad-TIMP-1后的小鼠原代成纤维细胞制剂治疗组可见大量的淋巴细胞浸润和明显的细胞坏死，尤以联合感染Ad-TIMP-1.1+Ad-End细胞制剂治疗组最为明显。 7.与Mock和Ad-GFP组相比，感染Ad-End、Ad-TIMP-1后的小鼠原代成纤维细胞制剂治疗组可以抑制黑色素瘤B16BL6细胞实验性肺转移，而联合感染Ad-TIMP-1和Ad-End的原代成纤维细胞制剂对小鼠黑色素瘤实验性肺转移的抑制具有明显的协同和累加效应(P<0.01)。 结论： 1.Gen抑制SGC7901细胞的增殖、迁移以及与单层HUVECs粘附可能是通过诱导SGC7901细胞中E-cadherin、B-catenin和actin的重排、下调p-FAK和E-cadherin的表达等实现的。 2.感染腺病毒的成纤维细胞分泌的TMP-1和End可以在体外显著抑制小鼠黑色素瘤B16BL6细胞的迁移、浸润以及与HUVECs的粘附。 3.接种感染相应腺病毒的原代成纤维细胞制剂可以表达并分泌TIMP-1和End到小鼠血清中并能在体内维持较高水平，可以显著抑制小鼠黑色素瘤细胞移植瘤的生长和实验性肺转移，而且联合感染TIMP-1和End的小鼠原代成纤维细胞制剂抑制效果更显著。 4.腺病毒介导的原代成纤维细胞制剂可能为临床治疗肿瘤的生长和转移提供一种新的基因治疗手段，具有潜在临床应用价值。基因治疗和细胞治疗联合运用能取得更好的抗肿瘤效果，有望成为一种新的肿瘤治疗模式。

目录

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声明

摘要

第一部分金雀异黄素抑制SGC7901细胞增殖、迁移和粘附的研究

1实验材料与方法

2实验结果与分析

3讨论

参考文献

第二部分腺病毒介导的原代成纤维细胞分泌TIMP-1和内皮抑素抑制小鼠黑色素瘤生长和转移的研究

1实验材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

综述1 金雀异黄素抗肿瘤生长的研究进展

综述2 肿瘤基因治疗方法的研究进展

附录

致谢

攻读学位期间主要研究成果