重组腺病毒介导E2F-shRNA转移抑制人视网膜母细胞肿瘤生长的实验研究

摘要

研究目的：观察腺病毒(Adenovirus，Ad)介导E2F—shRNA转移对人视网膜母细胞瘤(Retlnoblastoma，RB)眼前房移植瘤生长的抑制作用。 研究方法：利用脂质体介导编码E2F—shRNA的表达质粒体外瞬时转染肿瘤细胞，48小时后Realtime RT—PcR检测E2F1表达情况，PI（碘化丙酊)染色检测细胞周期各时相细胞数量及DNA含量；体内实验按50moi的剂量分别用Ad_E2F—shRNA(治疗组)、Ad-E2F-x(x为非治疗基因序列，对照组)体外感染表达绿色荧光蛋白(GFP)的人视网膜母细胞瘤细胞，48小时后收集细胞、计数，在手术显微镜下分别将2*105经上述感染的人视网膜母细胞瘤细胞注射到裸鼠左、右两侧眼前房内。术后5d起采用荧光体视镜连续观察双侧眼内肿瘤生长情况并拍摄照片，连续观察两周；待镜下肿瘤充满眼内前房，处死动物，取眼球及脑组织做石蜡包埋，病理切片眼球进行HE染色，观察双侧肿瘤组织在正常眼组织中所占的面积。 研究结果：编码E2F—shRNA的表达质粒瞬时转染肿瘤细胞48小时后，Realtlrne RT—PcR筛选到1个能在转录水平明显抑制靶基因hE2F1表达的sh—RNA序列；瞬时转染肿瘤细胞48小时后PI（碘化丙酊)染色检测到转染了hE2F1siRNA的细胞中s期细胞数明显减少；荧光体视镜下连续观察双侧眼前房内肿瘤生长情况存在明显差异；眼球组织HE染色示双侧肿瘤组织所占正常眼的比例存在差异，对照组肿瘤组织面积较大。 研究结论：能有效抑制hE2F1表达的shRNA具有抑制人视网膜母细胞瘤生长的作用，为人视网膜母细胞瘤的基因治疗提供了新的手段。