两株H9N2亚型禽流感病毒的传播特性和致病性的比较及62株的NA基因序列的测定和分析

摘要

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在包括我国在内的东南亚及世界许多国家分布广泛，中国大陆1994年首次公开报道从鸡群中分离到H9亚型AIV，随后便在一些地区形成小规模的流行，未波及全国。但1998年春夏开始的H9亚型禽流感在短短的几个月时间内就形成波及20多个省区的全国范围大流行，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。1998年以来我国发生的H9N2亚型AI传播效率高、速度快和范围广，1999年又从人类病毒中分离出H9N2亚型AIV，对于它存在的潜在危害已经越来越多的受到关注。为了解影响AIV传播效率的分子机制，本研究选择于2001年自中国上海某鸡场分离的两株H9N2亚型AIV: A/Chicken/Shanghai/7/2001(H9N2)(简称62株)、A/Chicken/Shanghai/14/2001(H9 N2)(简称70株)作为研究对象，比较了它们的传播途径特性和致病性，发现62株可以经直接接触和气溶胶途径传播，也能通过粪便接触传播，而70株只经直接接触途径传播。有研究表明NA基因可能是影响H9N2亚型AIV经气溶胶传播途径和传播效率的主要基因。因此本实验还就62株的NA基因进行序列测定和遗传进化分析。 一、62株和70株传播途径特性和致病性的比较 为研究H9N2亚型禽流感病毒的传播与复制特性，选用两株H9N2亚型AIV(A/Chicken/Shanghai/7/2001和A/Chicken/Shanghai/14/2001)，分别进行动物传播途径特性实验推断其传播特性。 将62株和70株经同一批10日龄SPF鸡胚复苏后，收集含病毒的尿囊液，经HA和HI实验证明是正确的毒株后，置于-70℃冰箱备用。接种前将种毒作1:10稀释后，按200μL/只的接种剂量，采用口服、滴鼻和气管接种的方法对4周龄的SPF鸡进行传播特性和致病性实验。对4周龄SPF鸡的致病性试验发现，62株对4周龄SPF鸡的致病力高于70株；62株在气管组织的病毒滴度和在消化道的复制水平皆比70株高，但62在消化道的复制能力又远远低于呼吸道的，70株尚未发现在消化道复制，证明62株和70株主要在呼吸道复制，62株比70株复制能力强。通过在4周龄SPF鸡的传播途径特性实验，发现62株和70株在直接接触，气溶胶传播和粪便接触3种传播途径存在差异：62株可以通过直接接触、气溶胶传播途径传播，也能通过粪便接触传播；70株仅仅通过直接接触传播。在直接接触传播特性上，62株和70株的传播效率相似，但62株的传播力度要强于70株的。通过对接种鸡和未接种鸡的HI试验，结果进一步证实了，62株可以经气溶胶途径传播，70株不能经气溶胶途径传播。 二、H9N2亚型禽感病毒62株的NA基因的序列测定和遗传进化分析 选择H9N2亚型上海分离株A/Chicken/Shanghai/7/2001(简称62株)，根据Hoff-mann通用引物，设计扩增基因的引物对，提取基因组RNA，用反转录，聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NA片段并测序。 将本实验所获得的62株的NA基因序列与GenBank中17株H9N2亚型流感病毒(包括GenBank中已经发表的62株的NA基因序列和70株的序列)的NA序列进行比较和遗传进化分析。 62株与70株的NA基因同源性是97.7％，与CK/BJ/1/94和CK/HK/G9/97都在同一分支。除去GenBank中62株的NA基因序列外，与62株同源性最高的是CK/SH/2/2001，同源性是99.8％，与CK/BJ/1/94的序列同源性是94.4％，与Q/HK/G1/97的同源性是89.9％，与人源H9N2亚型毒株HK/1073/99的同源性是90.4％，与HK/1074/99的同源性是89.9％。62株与17株H9N2亚型流感病毒的NA序列同源性范围是86.3％-99.9％，同源性最低的是与DK/HK/Y439/97，同源性为86.3％。与自1999年到2002年间上海地区分离的另外9株H9N2亚型禽流感病毒NA基因同源性较高，范围为94.4％-99.8％，说明它们之间在遗传演化地位上关系密切，同属于H9N2亚型AIV欧亚分支中的类C/BJ/1/94亚分，可能来源于C/BJ/1/94和CK/HK/G9/97。

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文献综述

1 A型流感病毒的形态和结构

2 A型流感病毒全基因的表达蛋白与流感病毒的毒力

2.1 HA与A型流感病毒的毒力

2.2 NA与A型流感病毒的毒力

2.3 PB2单个氨基酸的变化就可能导致流感病毒毒力很大的改变

2.4 PB1编码的流感病毒第十一种蛋白质(PB1-F2)可能对毒力起重要作用

2.5 NS1对于A型流感病毒在细胞水平上与宿主的相互作用起重要作用

2.6其它基因产物

3宿主与流感病毒毒力和种间传播

4 H9N2亚型禽流感病毒的致病性和复制特性

5 H9N2亚型禽流感病毒的研究现状及存在的问题

6结论

参考文献

第一章H9N2亚型禽流感病毒62株和70株的传播途径特性和致病性比较

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 62株和70株的血凝滴度测定

2.2 62株和70株在4周龄SPF鸡气管、肺和消化道组织中病毒的EID50结果

2.3 62株和70株在4周龄SPF鸡中传播途径试验结果

2.4 62株和70株对4周龄SPF鸡的致病性结果

3讨论

3.1 62株和70株在4周龄SPF鸡气管、肺脏和消化道中的复制能力比较

3.2 62株和70株传播途径特性的比较

3.3 62株和70株对4周龄SPF鸡的致病性

4结论

参考文献

第二章 H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken／shanghai／7／01(H9N2)NA基因的克隆测序和序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 RT-PCR扩增片段经克隆、测序和序列拼接结果

2.2 62株的NA基因与其它H9N2亚型流感病毒NA基因序列同源性比较

2.3 62株的NA基因的遗传进化分析

3讨论

4结论

参考文献

致 谢