CK/SH/F/98株H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和CK/SD/C9/11株生物学特性及表面基因序列分析

摘要

H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛流行和传播，给我国的养禽业造成了严重的经济损失。1999年首次出现H9N2亚型禽流感病毒感染人的报道。最近在我国部分省市出现了H7N9亚型禽流感病毒感染人并造成死亡的报道，该病毒可能是通过基因重排产生的新亚型禽流感病毒，因此禽流感病毒已对人类的健康和生命安全产生巨大的威胁。本论文研制了H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体，分析了单抗的特异性，并利用研制的单抗，通过免疫组织化学方法检测了SPF鸡感染H9N2亚型禽流感病毒后抗原在组织中的分布情况;本论文还探讨了新分离的一株H9N2亚型禽流感病毒的传播和复制特性，运用病理组织学和免疫组织化学方法对其进行了致病性方面的研究;同时对其HA基因和NA基因进行了序列测定和遗传进化分析。为H9N2亚型禽流感病毒的快速诊断、抗原性分析和流行病学调查提供了有价值的技术资料。
　　以我国流行的代表株A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2，简称F株）作为免疫原，通过差速离心法提纯后免疫8周龄BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术，通过HI试验和间接ELISA试验筛选出阳性细胞孔，并经三次有限稀释法克隆，获得了1C10、6D7两株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株细胞培养上清和腹水HI效价分别为27-8、213-14，腹水ELISA效价均达到了5×104以上;特异性实验表明两株细胞培养上清与H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合症病毒无任何交叉反应，仅与H9亚型禽流感病毒发生凝集抑制反应，具有良好的特异性;Western blotting分析显示两株单抗能与禽流感病毒75kd的蛋白发生特异性反应，表明了是针对H9亚型禽流感病毒HA蛋白的单抗;用F株尿囊液按107EID50接种剂量攻毒4周龄SPF鸡，第5天将其剖杀，通过免疫组织化学方法，利用所制备的单抗检测到鸡肺脏中的H9亚型AIV抗原的分布。
　　选取在山东齐河县新分离得到的一株H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Shandong/C9/2011，简称C9株，经测定C9株AIV的血凝效价为210-11，EID50和ELD50分别为1011.25/0.2mL、109/0.2mL，是很好的H9N2亚型禽流感病毒的疫苗候选株。但是该株的传播特性和复制特性还不清楚，因此本章对此进行了研究。将C9株AIV尿囊液按107EID50剂量通过口服、滴鼻和点眼的方法对4周龄SPF鸡进行传播特性和致病性实验。对4周龄SPF鸡的传播特性实验发现，C9株AIV主要在呼吸道复制，在消化系统也分离到病毒;可以通过直接接触、气溶胶传播途径和粪便接触途径传播。显微观察C9株感染鸡只后各组织的病理组织学变化，发现病变主要集中在气管和肺脏中，但消化系统未出现明显的病变;利用所制备的单抗在鸡气管和肺脏中检测到了C9株AIV抗原。
　　为从分子水平上了解C9株AIV HA基因和NA基因的变异情况，本论文第三章参照Genbank上已发表的H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因核苷酸序列设计出特异性扩增引物，利用RT-PCR的方法扩增出HA基因和NA基因，进行克隆和测序。通过对C9株AIV HA基因和NA基因的核苷酸同源性序列分析和遗传进化分析，结果表明了C9株AIVHA基因和NA基因都来自于Y280-1ike亚系，与其代表株A/Duck/Hongkong/Y280/97(H9N2)核苷酸同源性分别为92.8％、93.6％;进一步推导发现，C9株AIV与A/Duek/Hongkong/Y280/97(H9N2)的HA基因和NA基因的氨基酸同源性分别达到了94.4％和95.3％，亲缘关系较近;但与人源流感病毒A/HK/1073/99(H9N2)的HA基因和NA基因的核苷酸同源性分别为88.4％和89.7％。本研究中的C9株AIV HA基因裂解位点为R-S-S-R，是典型的低致病性H9亚型禽流感;在第218位缺失了一个潜在糖基化位点;在第190位的氨基酸突变为丙氨酸(Ala);在第226位的氨基酸由谷氨酸(Gln)突变为亮氨酸(Leu)，具备与人细胞受体结合的分子基础。而C9株AIV NA基因在63-65位缺失3个特征性的氨基酸，导致了1个糖基化位点缺失，其余糖基化位点均高度保守，红细胞吸附位点在第369位氨基酸由天冬氨酸(Asp)变成了天冬酰胺(Asn)。表明C9株的某些氨基酸发生了改变，但是否直接影响了C9株的传播性和致病性，还有待进一步研究。