转肽酶SrtA的表达纯化与结晶及其抑制剂的筛选

摘要

被公认为“超级细菌”的金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，它广泛地存在于人类的皮肤和粘膜表面。通常金黄色葡萄球菌感染可以用内酰胺类、大环内酯类或者喹诺酮类抗生素对其进行有效的治疗。但是由于抗生素的滥用导致金黄色葡萄球菌产生了广泛的耐药性。抗生素危机已经成为了全球性的挑战，寻找结构新颖的全新型抗生素的研究已经迫在眉睫。
　　 具有毒力因子功能的细菌表面蛋白正在成为新的抗菌药物研究的候选靶标。研究思想是通过调控细菌表面蛋白与宿主的相互作用，干扰细菌对宿主的入侵感染。SrtA酶是一种膜结合巯基转肽酶，能识别表面蛋白C端所含的保守氨基酸基序LPXTG(X是指任意的氨基酸)，并裂解苏氨酸(T)和甘氨酸(G)间的肽键，产生一个苏氨酸的羰基末端，与细胞壁的五个甘氨酸交联桥的氨基形成酰氨键，从而使表面蛋白被锚定到细胞壁的肽聚糖上。由于这种酶广泛存在于很多重要的人类病原菌内，如单核细胞增多型李氏杆菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌等，基于转肽酶的作用机制以及小分子抑制剂的研究，为解决针对金黄色葡萄球菌甚至广谱的细菌感染的化学治疗难题必将提供有力的理论依据。
　　 SrtA酶由206个氨基酸组成，它的N端部分是一个跨膜区，C端部分则是一个催化区域。SrtA△N59在体外与SrtA的功能相同，能够与底物LPXTG发生转肽反应，催化T和G之间的断裂。根据已知SrtA的基因序列，我们设计了两对SrtA△N59基因序列的引物，用聚合酶链式反应(PCR)扩增。其中一个PCR产物经限制性内切酶BamhI和SalI双酶切后克隆到载体pQE30中，另一个PCR产物经限制性内切酶NdeI and XhoI双酶切后克隆到载体pET28b中。在大肠杆菌中表达重组蛋白SrtA△N59，并利用AKTA纯化仪对其进行纯化，得到了纯度高于90％的SrtA△N59蛋白。将纯化后的SrtA△N59蛋白浓缩为50mg/ml，采用悬滴法筛选晶体，在Grid试剂盒的D4和D5得到了SrtA的晶体。
　　 为了筛选SrtA酶的小分子抑制剂，我们利用荧光共振能量转移的原理，合成SrtA酶的底物(O-aminobenzoyl-LPATG-diaminopropionic acid-dinitrophenyl-NH2，Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2)。当底物中LPATG没有被SrtA酶切断时，在一定波长的荧光的吸收很弱，但当其被SrtA酶切断后，则在此波长的荧光吸收将会大大增强。在筛选SrtA酶抑制剂的过程中，我们通过监测酶抑制反应后的荧光吸收值来判断小分子化合物的活性。最后我们筛选出3个具有较强的抑制活性，它们的IC50值分别为126.82μM、138.26μM和192.85μM。这项研究为以后SrtA抑制剂的发现和它们之间构效关系的分析奠定了基础。

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文献综述

1 引言

2金黄色葡萄球菌的致病机理

3金黄色葡萄球菌的耐药机制

3.1 金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

3.2金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制

3.3金黄色葡萄球菌对林可霉素类抗生素的耐药机制

3.4金黄色葡萄球菌对喹诺酮类药物的耐药机制

3.5金黄色葡萄球菌对四环素类抗生素的耐药机制

3.6金黄色葡萄球菌对糖肽类抗生素的耐药机制

4 金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus)转肽酶SrtA

4.1 SrtA的同系物

4.2 SrtA的催化反应机制

4.3 SrtA的三维结构

4.4 SrtA的抑制剂

5对转肽酶SrtA的研究意义

5.1 意义

5.2 目的

第一章 SrtA蛋白的表达、纯化

1 实验原理

1.1 基因的克隆与表达

1.2蛋白质的分离与纯化

2材料和方法

2.1 材料

2.2方法

3结果

3.1 原核表达载体pQE30-SrtA△N59和pET28b-SrtA△N59的成功构建

3.2 pQE30-SrtA△N59和pET28b—SrtA△N59重组蛋白的纯化

4讨论

第二章 SrtA的结晶

1 实验原理

2材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3结果

3 讨论

第三章 SrtA抑制剂的筛选

1 计算机模拟筛选

1.1药效团筛选

1.2分子对接筛选

1.3聚类分析和挑选

2体外筛选实验

2.1 原理

2.2材料和仪器

2.3方法

2.4结果

3讨论

全文结论

参考文献

致谢