辣椒疫霉菌效应分子RxLR101012表达、纯化、结晶初探与RxLR101860互作蛋白筛选

摘要

辣椒疫病是一种重要的土传病害，分布广泛，病原菌辣椒疫霉寄主范围广，能够侵染包括辣椒、番茄、黄瓜等20多种寄主， 病菌孢子能够在寄主病残体和土壤中越冬，可随风、雨水、灌溉等农事活动传播，孢子萌发后进行再侵染。近年来，关于辣椒疫霉致病因子及致病流行机制的研究已经越来越引起大家的关注。疫霉在给作物生产带来巨大经济损失的同时也会给生态环境带来危害。 由辣椒疫霉引起的作物经济损失逐年增加。植物病原卵菌在进行定殖并侵染寄主植物过程中会分泌一系列的效应蛋白分子(effectors)，效应分子通过损坏或干扰寄主细胞的正常代谢，从而促进病菌侵染及效应分子的分泌和传递。病原卵菌分泌的效应分子分位两类，一类是质外体效应分子，另一类是胞质效应分子。胞质效应分子又有两类，一类是RxLR效应分子，它们大都有保守的N端序列，C端无保守的功能域。大部分RxLR效应分子N端都含有一个RxLR序列，因此被称为RxLR效应分子。另一类效应分子的N端含有一段保守序列LxLFLAK，称为皱缩坏死蛋白(Crinklers, CRNs)。本文主要研究的是胞质RxLR效应分子。 有关辣椒疫霉胞质效应分子蛋白表达纯化及蛋白晶体学的研究资料积累较少，对胞质效应分子结构生物学的研究起步较晚。本研究成功克隆了辣椒疫霉的 1 个 R x L R 效应分子(RxLR101012)，基于原核表达及蛋白纯化技术包括亲和层析、离子交换层析和凝胶排阻层析等技术获得了该效应分子高纯度的可溶性蛋白溶液，并利用气象扩散原理通过坐滴法对其结晶条件进行了筛选，得到了该效应分子的蛋白晶体，并进行了X-ray衍射，通过条件优化，使晶体的衍射数据达到了3.8?。该研究为继续进行蛋白晶体优化培养及结构研究提供了基础。 胞质效应分子被分泌转运进入寄主细胞后，通过与目标蛋白相结合，从而调控寄主的免疫应答反应。本研究利用酵母双杂技术筛选得到了效应分子 RxLR101860的四个互作蛋白，并通过酵母双杂一对一共转化实验进行了验证。克隆得到了互作蛋白的全基因，构建了双分子荧光互补载体以及免疫共沉淀载体，验证载体正确后开展相关的实验进行互作验证。通过对效应分子RxLR101860互作蛋白的筛选和互作验证为进一步阐明该效应分子在寄主免疫防卫过程中的作用及病原菌致病机理研究提供了依据。 通过本研究，我们初步得到了效应分子RxLR101012的蛋白晶体，为晶体优化和结构生物学研究积累的经验，得到了效应分子RxLR101860的互作蛋白，为病原卵菌和寄主互作研究提供了依据。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1 前言

1.1 辣椒疫霉研究概述

1.2 卵菌效应分子的研究

1.3 蛋白表达纯化技术

1.4 效应分子与寄主蛋白互作的研究技术

2 材料方法

2.1 材料

2.2 试验方法

3 结果分析

3.1 辣椒疫霉效应分子RxLR101012的引物设计与克隆

3.2 效应分子RxLR101012与效应分子RxLR101860的理化性质分析

3.3 RxLR101012蛋白表达纯化

3.4 蛋白晶体的初筛

3.5 效应分子RxLR101860的互作蛋白筛选

4 结论与讨论

4.1 效应分子RxLR101012的扩增和原核表达载体构建

4.2 效应分子RxLR101012的蛋白晶体优化

4.3 效应分子RxLR101860互作蛋白的酵母筛选

4.4 双分子荧光互补载体构建及免疫共沉淀载体构建

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章