禽病原性大肠杆菌E058株iutA、iucB及chp1、chp2基因突变株的构建及其致病性评价

摘要

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的局部或全身性感染的疾病，包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型复杂多样，在APEC中最常见的血清型是O1、O2和O78。铁是细菌代谢必须的营养因子，细菌生长所需铁(离子)浓度约为10-7 M，病原性大肠杆菌天然形成了特定的利用铁元素的系统(specificiron assimilation system)，Williams最早在大肠杆菌中发现了这一系统[1]，这一系统由嗜铁体(siderophore)、气杆菌素(aerobactin)的合成和气杆菌素特定的外膜蛋白受体(由iutA编码)的表达两部分组成。细菌的这两种成分在铁饥饿(ironstarvation)的情况下，均能得到强烈诱导表达。流行病学调查表明，气杆菌素相关基因只存在于有毒力菌株，在无毒力菌株中未发现。本研究旨在研究气杆菌素家族的iutA、iucB基因与致病性之间的关系，了解APEC iutA与iucB基因突变株的生物学特性。本研究的实施，有利于澄清APEC ColV质粒编码的气杆菌素编码基因iucABCDiutA中单个基因及其组合对其致病性的影响，为揭示APEC的致病机理及进一步构建APEC弱毒疫苗株奠定基础。
　　 本研究第一章运用等位基因交换的方法构建iutA、iucB的单基因和双基因缺失突变株。PCR扩增带有酶切位点的iutA、iucB基因并将其插入到pBSK载体多克隆位点中相应酶切位点处，再运用分子克隆的方法将Kanamycin抗性基因和Zeocin抗性记忆分别插入插入到目的基因iutA和iucB中，构建出带Kanamycin抗性基因标志的载体pS-iutA-Kan和带Zeocin抗性基因标志的载体pS-iucB-Zeo，通过PCR扩增片段iutA-Kan和iucB-Zeo，并电转化入禽病原性大肠杆菌分离株E058中，根据同源重组原理，筛选出E058株的基因突变株E058iutA及E058iucB，将片段iucB-Zeo电转化入单突变株E058iutA中，筛选出双突变株E058iutAiucB。
　　 Southern blot的结果显示Kanamycin、Zeocin抗性基因在APEC E058株基因突变株的pAPEC-O2-ColV质粒中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明突变株的iutA、iucB基因不能转录，而其上下游基因的转录未受到影响；SDS-PAGE结果表明iutA、iucB基因突变后，蛋白条带大小及表达量发生了变化，通过回复拯救试验，可见蛋白表达与野生株E058一致；气杆菌素产生试验及ColV产生试验结果表明，E058、E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB均能产生气杆菌素和ColV；E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB株较E058株在生长速度上稍有降低；在血清杀菌性实验中，突变株对SPF鸡血清的补体杀菌作用不敏感；体内外竞争实验结果表明，突变株对E058株竞争力很弱；E058、E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB株的半数致死量(LD50)为分别为104.7、105.7、105.8和106.8CFU；在35日龄SPF鸡的致死性试验中，E058株所致死亡率为95％，而E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB突变株所致死亡率分别为70％(p＜0.05)，60％(p＜0.01)及45％(p＜0.01)；12日龄SPF鸡胚的致死性实验结果表明，E058组死亡率为63.3％，而E058iutA、E058iucB及E058iutAiucB突变株组死亡率为40％、33.3％(p＜0.05)及30％(p＜0.01)。SDS-PAGE结果表明iutA、iucB基因突变后，蛋白条带大小及表达量发生了变化，通过回复拯救试验，可见蛋白表达与野生株E058一致，上述结果揭示iutA、iucB基因与APEC E058株的致病性有一定的关系。
　　 基于实验室前期《禽病原性大肠杆菌的生物学特性及其可能毒力相关基因二》的研究中，抑制差减杂交(SSH)获得32个APEC E058株基因差异片段之一的aes-31序列，其功能未知，与UPEC同源。本实验第二部分选择aes-31片段作为研究对象，运用等位基因交换的方法构建chp1、chp2的单基因和双基因缺失突变株。PCP扩增chp1、chp2基因并将其插入到pBSK载体的多克隆位点中，再运用分子克隆的方法将Zeocin抗性基因和Kanamycin抗性基因分别插入插入到目的基因chp1和chp2中，构建出带Zeocin抗性基因标志的载体pSK-chp1-Zeo和带Kanamycin抗性基因标志的载体pSK-chp2-Kan，通过PCR扩增片段chpl-Zeo和chp2-Kan，并电转化入禽病原性大肠杆菌分离株E058中，根据同源重组原理，筛选出E058突变株E058chp1及E058chp2，将片段chp1-Zeo电转化入E058chp2，筛选出双突变株E058chp1chp2。
　　 Southern blot结果显示Zeocin抗性基因片段的插入是单拷贝的，Kanamycin抗性基因片段在chp2突变株全基因组中插入了两个拷贝；RT-PCR结果表明被突变的chp1基因已经不能反转录，未被完全突变的chp2基因仍能反转录，其上下游基因并未受到影响；生长曲线测定结果显示，E058chp1、E058chp2及E058chp1chp2的生长速度低于亲本株E058；E058、E058chp1、E058chp2和E058chp1chp2的半数致死量(LD50)为分别为104.6、106.3、105.4和106.5CFU，结果表明，chp1、chp2基因与APEC E058株的致病性有关。

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综述

1禽病原性大肠杆菌的血清型

2荚膜

3脂多糖

4黏附素

5温度敏感性血凝素

6铁摄取系统

7外膜蛋白(OMP)

8毒素

9大肠杆菌素

10 AGI-3基因组岛

11侵袭素IbeA

12Pst系统

13与其他致病因子的相互作用

第一章 禽病原性大肠杆菌E058株iutA、iucB基因突变株的构建及其致病性的研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二章 禽病原性大肠杆菌E058株chp1，chp2基因突变株的构建及其致病性的研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

全文总结

参考文献

致 谢