人源抗伊维菌素单链抗体的筛选、表达及结构功能分析

摘要

伊维菌素是由阿维链霉菌发酵合成的一种大环内酯类多组分抗生素，被有效用作农药、兽药及人抗寄生虫药物。它能打开谷氨酸控制的Cl-通道，导致膜超极化，使肌肉细胞丧失收缩能力，从而导致虫体死亡。长期以来，伊维菌素被认为是安全的抗寄生虫药物，但是近年的研究结果表明，它的残留能降低牧草产量，影响水生群落，对环境平衡有重大威胁。伊维菌素的广泛应用和潜在危害的并存，使得建立一种简单高效的伊维菌素残留检测方法很有必要。
　　 目前建立的伊维菌素检测方法主要有中空纤维支撑液膜萃取法和液相色谱质谱-质谱法。这些方法需要昂贵的仪器及繁琐的前处理步骤，相比之下，免疫检测法较为快速、经济。现已有关于伊维菌素单克隆和多克隆抗体的报道，还未见其单链抗体的报道。本研究在参照国内外相关研究的基础上，以期从人源噬菌体抗体库中筛选出抗伊维菌素的单链抗体，并对其进行可溶性表达、蛋白结构功能分析，为环境及农产品中伊维菌素的安全监控提供材料，为研究抗原抗体反应提供理论基础。噬菌体展示技术是一种制备高亲和力抗体的有力工具，抗体库技术则为筛选高亲和力抗体提供了良好的平台。展示抗体的基因型与表现型的有效统一，使其不仅在农药残留检测及抗体制备等方面具有广泛应用前景，还能有效地应用于基因工程改造。
　　 研究目的和意义：应用噬菌体抗体库技术，筛选人源抗伊维菌素单链抗体，以期应用于伊维菌素的安全监控。对筛选出的抗体进行可溶性表达、纯化后鉴定其免疫活性。对抗体的结构功能进行分析，为研究抗原抗体结合反应提供理论基础。
　　 研究方法：以伊维菌素-牛血清白蛋白为包被抗原，应用噬菌体抗体库技术，从库容约为108的人源噬菌体抗体库中筛选出抗伊维菌素单链抗体。采用固相消减筛选法，共进行4轮“吸附-洗脱-富集”。对结合活性较强的阳性克隆，制备噬菌体上清，转化E.coli HB2151，以IPTG进行诱导，表达的可溶性抗体过镍亲和层析柱纯化，建立竞争抑制ELISA检测方法，进行灵敏度测定。应用计算机软件及生物信息学站点对抗体的结构功能进行分析。
　　 研究结果：经过四轮富集筛选，从人源抗体库中筛选出7株不同的阳性克隆，hsIVM8展示了最高的亲和力。IPTG成功诱导表达hsIVM8，SDS-PAGE显示其分子量约为28 kD，伊维菌素对纯化抗体的抑制中浓度IC50为4.11μg/mL，线性检测范围为0.1-5μg/mL。
　　 研究成果：从人源噬菌体抗体库中成功筛选到抗伊维菌素的单链抗体，有望应用于环境和农产品中伊维菌素的安全监控。对抗体蛋白进行的结构功能分析为研究抗体性质及与抗原反应机理提供理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照词

声明

第一章文献综述

1 噬菌体展示技术

1.1丝状噬茵体展示系统

1.2 λ噬菌体展示系统

1.3 T4噬菌体展示系统

1.4 T7噬菌体展示系统

1.5噬菌体展示技术特点

2抗体

2.1抗体的结构

2.2抗体的发展

3 噬茵体抗体库技术

3.1噬菌体抗体库技术的产生

3.2噬菌体抗体库的筛选方法

3.3噬菌体抗体库技术的应用

4单链抗体在大肠杆菌中的表达

4.1单链抗体表达方式

4.2培养条件的优化

5单链抗体的结构功能分析

第二章抗伊维菌素单链抗体的筛选

1材料与方法

1.1实验材料

1.2噬菌体抗体库的初步鉴定

1.3抗IVM抗体的筛选

1.4单克隆噬菌体ELISA鉴定抗IVM噬菌体抗体

1.5阳性克隆外源基因序列鉴定

2试验结果

2.1噬菌体抗体库的初步鉴定

2.2抗IVM抗体的筛选

2.3单克隆噬菌体ELISA鉴定抗IVM噬茵体抗体

2.4阳性克隆外源基因序列鉴定

3讨论

第三章 抗伊维菌素单链抗体诱导表达及免疫活性鉴定

1材料与方法

1.1实验材料

1.2 hsIVM8噬菌体上清制备

1.3 hsIVM8噬菌体感染E.coli HB2151

1.4诱导表达可溶性抗体

1.5 HisTrap HP镍亲和柱纯化抗IVM可溶性抗体

1.6纯化抗体灵敏度测定

2试验结果

2.1 hsIVM8噬菌体感染E.coli HB2151

2.2可溶性抗体的诱导表达及纯化

2.3纯化抗体灵敏度测定

3讨论

第四章 hsIVM8噬菌体抗体蛋白结构功能分析

1材料和方法

1.1材料

1.2 IVM单链抗体理化性质分析

1.3蛋白质结构功能预测

2结果

2.1 IVM单链抗体的理化性质

2.2蛋白质功能基序分析

2.3 蛋白二级结构预测

2.4蛋白质亚细胞定位预测

2.5蛋白酶切位点预测

3讨论

全文总结

附录

参考文献

致谢

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