边鸡遗传多样性及Myostatin基因对生长和繁殖性状的遗传效应研究

摘要

本研究利用29个微卫星标记研究边鸡0世代群体的遗传多样性，并与2个对照品种(京海黄鸡和尤溪麻鸡)的遗传多样性进行比较；选择0世代边鸡群体中等位基因数在4个以上的21个微卫星标记研究1世代边鸡群体的遗传多样性，并与0世代边鸡群体的遗传多样性进行比较以了解边鸡群体的保种效果；采用PCR-SSCP技术检测边鸡及3个对照品种(京海黄鸡、尤溪麻鸡和AA鸡)肌肉生长抑制素基因(Myostatin)的单核苷酸多态性，并与边鸡的生长和繁殖性状进行相关分析，为边鸡群体的标记辅助选择提供依据；运用荧光定量PCR技术分析边鸡Myostatin基因G2283A位点形成的3种基因型在胸肌、腿肌和卵巢中表达量的差异，以探讨这一位点对边鸡的生长性状和繁殖性状具有显著效应的分子机理，同时分析边鸡Myostatin基因在胸肌、腿肌和卵巢中表达量的差异。主要研究结果如下：
　　 1.利用29个微卫星标记在3个鸡品种(边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡)中总共检测到166个等位基因，其中32个等位基因为某一品种所特有。边鸡拥有的特有等位基因最多，为15个(46.9％)，京海黄鸡次之，为12个(37.5％)。边鸡的平均多态信息含量(0.5168)和平均期望杂合度(0.5750)最高，京海黄鸡的平均多态信息含量(0.4915)和平均期望杂合度最低(0.5505)。在29个微卫星位点中，边鸡群体有15位点为高度多态位点，其余14个位点为中度多态位点。京海黄鸡和尤溪麻鸡的高度多态位点数分别为17和14个。在3个品种中一些位点显著的偏离哈代-温伯格平衡，杂合子缺失的水平也很高。通过固定指数(Fst)估计品种间的遗传分化为6.7％(P＜0.001)。群体内的杂合子缺失(Fis)为22.2％(P＜0.001)。边鸡的近交系数最高(0.249)，京海黄鸡的最低(0.159)。这些研究结果可为边鸡、京海黄鸡以及尤溪麻鸡的遗传特征研究和保种提供初步依据。
　　 2.选用的等位基因数在4个以上的21个微卫星标记在2个世代的边鸡群体中共检测到122个等位基因，其中102个为两个世代所共有，19个为0世代所特有。0世代和1世代的边鸡群体的平均多态信息含量(PIC)分别为0.5473和0.5437；平均期望杂合度分别(He)为0.5967和0.6009；近交系数(Fis)分别为0.233和0.134。经过一个世代的繁育，PIC和He两个指标维持在原有水平，而群体的近交系数有所下降，说明采用的保种方法很好的保存了边鸡的遗传多样性，同时避免了近交程度过高而导致群体出现近交衰退。
　　 3.在4个鸡品种Myostatin基因中总共检测到17个突变，其中10个突变(A326G、C334G、G673A、G985C、G1085A、A1278T、C1346T、G1375A、A1473G和G1491A)位于5'调控区，4个突变(G2100A、G2109A、C2244G和G2283A)位于外显子1，3个突变(C7552T，C7638T和T7661A)位于外显子3。编码区的突变都未导致氨基酸的改变。
　　 4.边鸡、京海黄鸡、尤溪麻鸡和AA鸡Myostatin基因中分别有7、9、9和5个位点表现出多态。边鸡MYOE1-2位点为高度多态位点，MYO1和MYOE1-3位点为中度多态位点，其余4个位点为低度多态位点。京海黄鸡、尤溪麻鸡和AA鸡中高度多态位点数分别为1、2、0个，中度多态位点数都为4个。
　　 5.通过在线软件预测发现4个鸡品种Myostatin基因5'调控区的突变总共导致10个转录因子结合位点(E2F、CRE-BP、CREB、HFH-2、NKx-2、CdxA、Oct-1、V-Maf、Tst-1和C/EBPα)发生了改变。
　　 6.边鸡Myostatin基因5'调控区MYO1、MYO6和MYO7位点以及外显子区MYOE1-2、MYOE1-3位点对边鸡的生长性状具有显著或极显著的影响(P＜0.05或P＜0.01)，推测Myostatin基因可能是影响边鸡生长性状的主效基因或与主效基因相连锁的一个标记。MYOE1-3位点DE和EE基因型的6-18周龄体重都显著或极显著的高于EE基因型(P＜0.05或P＜0.01)，并且具有EE基因型的体重＞DE基因型＞EE基因型的规律，MYOE1-3位点在边鸡生长性状的标记辅助选择方面具有很大的应用潜力。
　　 7.边鸡Myostatin基因5'调控区MYO1、MYO6和MYO7位点对边鸡的开产体重有显著的影响(P＜0.05)，外显子区MYOE1-2、MYOE1-3、MYOE3-2和MYOE3-3位点对边鸡的开产日龄和300日龄产蛋数具有显著或极显著的影响(P＜0.05或P＜0.01)，推测Myostatin基因可能是影响边鸡繁殖性状的的主效基因或与主效基因相连锁的一个标记。MYOE1-3位点DE基因型的开产日龄显著的早于DD基因型(P＜0.05)，EE基因型的开产日龄极显著的早于DD基因型(P＜0.01)；MYOE1-3位点DE基因型的300日龄产蛋数显著的高于DD基因型(P＜0.05)，EE基因型的300日龄产蛋数极显著的高于DD基因型(P＜0.01)，MYOE1-3位点在边鸡300日龄产蛋数的标记辅助选择方面具有很大的应用潜力。
　　 8.边鸡Myostatin基因7个多态位点两两组合对边鸡的生长性状和繁殖性状的互作效应达到显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)的水平。
　　 9.通过荧光定量PCR技术发现Myostatin基因G2283A位点形成的3种基因型(DD、DE和EE)在胸肌、腿肌中的表达量存在差异，在卵巢中的表达量没有差异。在胸肌中，野生型(DD)的表达量是突变杂合型(DE)的表达量的1.40倍，是突变纯合型(EE)的4.66倍。在腿肌中，野生型的表达量是突变杂合型的表达量的1.27倍，是突变纯合型的8倍。研究结果还表明Myostatin基因主要在胸肌和腿肌中表达，在卵巢中只有微量表达，胸肌中的表达量是卵巢中的471.1倍，腿肌中表达量是卵巢中的501.5倍。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.遗传多样性的概念、意义及研究方法

1.1遗传多样性的概念

1.2遗传多样性研究的作用和意义

1.3动物遗传多样性的研究方法

2.微卫星标记及在遗传育种中的运用

2.1微卫星标记的概况

2.2微卫星的功能和形成机理

2.3微卫星标记在遗传育种中的运用

3.Myostatin基因的研究进展

3.1 Myostatin基因的发现

3.2 Myostatin基因的定位

3.3 Myostatin基因的结构

3.4 Myostatin作用机理

3.5 Myostatin基因的生物学功能

3.6 Myostatin基因的多态性与生产性能的关系

4.实时荧光定量PCR技术

4.1实时荧光定量PCR技术的基本原理

4.2荧光定量PCR的定量方法

4.3荧光定量PCR反应方法的分类

4.4实时荧光定量PCR的应用

5.边鸡以及3个对照鸡种介绍

6.本研究的目的和意义

第二章 边鸡微卫星DNA遗传多样性分析

1材料和方法

1.1实验材料

1.2试验方法

1.3统计分析

2结果与分析

2.1微卫星引物的PCR产物电泳

2.2品种内的遗传变异分析

2.3品种的遗传分化

2.4哈代温伯格平衡

2.5近交系数

3.讨论

3.1样本量的确定

3.2群体内的遗传多样性

3.3群体内的近交系数

3.4群体间的遗传分化

第三章 边鸡群体的保种效果

1材料和方法

1.1试验材料

1.2主要实验仪器

1.3主要实验试剂及配制方法

1.4微卫星引物

1.5统计分析方法

2结果与分析

2.1 2个世代边鸡的微卫星座位的等位基因数

2.2多态信息含量

2.3期望杂合度

2.4观察杂合度

2.5近交系数

3讨论

3.1世代间群体遗传多样性的变化

3.2世代间近交系数的变化

3.3对边鸡保种的建议

第四章 Myostatin基因的多态性及其与边鸡生长和繁殖性状的关联分析

1材料与方法

1.1试验材料

1.2主要仪器

1.3主要试剂及配制

1.4引物设计及PCR扩增

1.5分析工具

1.6 SSCP分析

1.7 PCR产物的回收

1.8 PCR产物的克隆

1.9数据的统计分析

1.10统计分析模型和软件

2结果与分析

2.1鸡基因组DNA和PCR产物结果

2.2 Myostatin基因SSCP检测及序列分析

2.3转录因子结合位点的预测

2.4边鸡Myostatin基因氨基酸序列分析

2.5边鸡Myostatin蛋白的理化性质和功能域预测

2.6群体遗传学分析

2.7 Myostatin基因与生长和繁殖性状的关联分析

2.8 Myostatin基因不同位点间的互作效应

3讨论

3.1 4个鸡品种Myostatin基因的群体遗传学分析

3.2 Myostatin基因转录因子结合位点的功能

3.3 Myostatin基因的多态性

3.4 Myostatin基因与生长性状的关联分析

3.5 Myostatin基因与繁殖性状的相关性分析

3.6 Myostatin基因不同位点对生长和繁殖性状的互作效应

第五章 Myostatin基因表达的研究

1材料与方法

1.1试验鸡群和样本采集

1.2主要试剂

1.3主要仪器设备

1.4分析工具软件

1.5实验方法

1.6统计软件和方法

2结果与分析

2.1 RNA的提取结果

2.2常规PCR及测序结果

2.3目的基因和内参基因的溶解曲线

2.4 Myostatin基因的扩增曲线

2.5目的基因和内参基因的标准曲线

2.6 3种基因型的表达水平相对定量分析

2.7 3种组织中Myostatin基因的表达水平分析

3讨论

3.1内参基因的选择

3.2荧光定量PCR引物的设计

3.3 Myostatin基因的组织表达

3.4 Myostatin基因的表达与生产性状的关系

全文结论

创新之处

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文