HSP70-2基因多态性对北京油鸡精液品质的影响及其抗热应激功能验证

摘要

本研究以北京油鸡种公鸡为试验材料，以热休克蛋白70-2基因(HSP70-2)为候选基因，分析该基因5'侧翼区和编码区的遗传多态性与北京油鸡公鸡精液品质的相关性，并研究热应激对不同基因型公鸡繁殖性状及HSP70-2基因mRNA表达量的影响。旨在为北京油鸡繁殖力标记辅助育种研究奠定基础。
　　 试验一：选用220只北京油鸡成年公鸡为研究对象，检测HSP70-2的多态性，并分析其多态性及基因型(组合)对精液品质性状的影响。试验二：在试验一基础上，按基因型组合选用84只30周龄北京油鸡公鸡，分成热应激组(37℃，10h；30℃，14h)和对照组(23℃；24h)，应激10天，测定精液品质、受精率、入孵蛋孵化率、受精蛋孵化率、健雏率及HSP70-2基因mRNA表达量。研究不同基因型及其组合公鸡抗热应激能力的差异。主要研究结果如下：
　　 1.采用PCR-SSCP、PCR-RFLP及测序技术对HSP70-2基因进行多态性筛查，结果发现A-68G(P5)、G286C(P7)和A1054G(P8)三个突变。用TFSEARCH软件预测发现，P5位点的突变产生了一个MZF-1调控元件的结合位点，可能对HSP70-2基因的转录产生影响；编码区P7和P8位点发生的突变为沉默突变，未引起氨基酸序列的改变。多态位点基因型与精液品质关联分析表明，5'侧翼区P5位点AG基因型为精子活力、精子活率、精子畸形率的不利基因型，编码区P7位点GG基因型为精子活力和精子畸形率的优势基因型，P8位点AG基因型为精液pH和精子畸形率的不利基因型。
　　 2.P5、P7和P8三位点两两组合基因型与精液品质性状关联分析的结果表明，P5P7位点AGCC基因型组合和P5P8位点AGAG基因型组合为精子活力及畸形率的不利基因型。
　　 3.选择P5、P8两个位点共五种组合基因型个体进行热应激试验，结果表明，应激后五种基因型组合个体精子活力均出现不同程度下降，畸形率较对照组显著升高(P＜0.05)。AGAG型的精液品质受热应激影响下降最严重。五种基因型组合HSP70-2基因mRNA表达检测结果表明，不同处理组相同基因型间表达差异显著(p＜0.05)，热应激后AAAA型最高，AGGG型最低。不同基因型相同处理组间表达差异显著(p＜0.05)，AA型在应激组中最高，AGAG基因型表达量受热应激影响最大。
　　 4.孵化试验结果表明，P5P8热应激期间，P5、P8两个位点组合中突变纯合基因型GGGG型受精率、孵化率和健雏率高于杂合基因型AGAG型。两种基因型热应激期的受精率、孵化率和健雏率显著低于恢复期，应激结束一至两周后恢复正常。AGAG基因型受精率、孵化率和健雏率受温度影响较大。
　　 综上所述，HSP70-2基因的突变可能是影响北京油鸡精液品质的重要因素之一，剔除P5P8组合中AGAG不利基因型个体，可能提高北京油鸡的繁殖性能。同时，本试验首次从鸡繁殖性能角度验证了HSP70-2基因抗热应激功能的存在。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：常用词语缩写

声明

第一章文献综述

1.公畜繁殖性状的研究意义

2. HSP70-2基因研究进展

2.1 HSP70-2与精子发生

2.2 HSP70-2基因结构及定位

2.3 HSP70-2作为鸡繁殖性状分子标记的可行性

3.热应激与繁殖性状

3.1热应激

3.2热应激对种公畜繁殖机能的影响

4.遗传标记辅助选择

4.1遗传标记

4.2单核苷酸多态性

4.3 SNPs的检测方法

5.实时荧光定量PCR分析技术

5.1实时荧光定量PCR的原理

5.2实时荧光定量PCR的定量方法

第二章北京油鸡脚HSP70-2基因多态性与鸡精液品质性状的相关性研究

1.材料

1.1试验动物与饲养

1.2样品的采集

1.3主要试剂

2.试验方法

2.1精液品质测定

2.2鸡基因组DNA提取

2.3引物设计及扩增

2.4测序

2.5 PCR-SSCP

2.6酶切

2.7数据统计和分析

3.结果

3.1北京油鸡基因组DNA和PCR产物结果

3.2北京油鸡HSP70-2基因多态性分析结果

3.3 HSP70-2基因多态性与精液品质相关性状最小二乘分析

4.讨论

4.1基因组DNA的提取及检测

4.2关于影响PCR扩增反应的因素

4.3 PCR-SSCP法的优化

4.4 PCR-RFLP法

4.5 HSP70-2基因单核苷酸多态分析

5.结论

第三章热应激对HSP70-2基因不同组合基因型公鸡繁殖性能的影响

1.试验材料

1.1试验动物与饲养

1.2样品的采集

1.3主要试剂

2.试验方法

2.1精液品质测定

2.2受精率、孵化率及健雏率

2.3实时荧光定量PCR引物设计

2.4总RNA提取及cDNA第一链合成、检测

2.5荧光定量PCR

2.6统计分析

3.结果

3.1短期热应激对北京油鸡种公鸡精液品质的影响

3.2热应激对不同基因型组合受精率、孵化率及健雏率的影响

3.3 RNA及反转录检测

4.讨论

4.1短期热应激对北京油鸡HSP70-2基因不同基因型精液品质影响

4.2短期热应激对北京油鸡HSP70-2基因不同基因型种蛋受精率、孵化率和健雏率的影响

4.4 HSP70-2基因不同基因型表达分析

5.结论

第三章全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文目录