北京油鸡种公鸡精液品质相关候选基因的SNPs分析及转录研究

摘要

精液品质是衡量种公鸡繁殖能力的一个重要指标，其优劣直接影响种蛋受精率乃至后代的生产性能。对精液品质的检测，挑选优秀种公鸡用于生产是家禽生产的重要保证。本研究以北京油鸡种公鸡为试验材料，以BSG，SPEE1，SPATA4，SPAG6，P2X7，ANXA7基因为候选基因，分析候选基因的遗传多态性与北京油鸡精液品质及性发育相关性状的关联性，同时采用实时荧光定量PCR法研究候选基因在高、中、低精液量试验组中睾丸组织mRNA表达量的差异，旨在为精液品质相关候选基因的筛选及分子标记辅助选择的应用提供参考依据，为北京油鸡繁殖力标记辅助育种研究奠定基础。
　　 选择89只35周龄北京油鸡种公鸡，采用MALDI-TOF-MSSNP技术进行基因分型，利用Phase软件和Haploview软件进行单倍型分析，构建线性模型，对单个位点、单倍型与精液品质和性发育相关性状进行关联分析。在试验一基础上，选用89只58周龄北京油鸡公鸡，根据精液量高低分组取睾丸组织，采用实时荧光定量PCR法研究候选基因在高、中、低精液量试验组中睾丸组织mRNA表达量的差异。主要研究结果如下:
　　 1、候选基因共筛选出16个SNPs位点，关联分析单个位点研究发现，SPAG6基因C29756T和T23041C位点与精液量、精子活率和精子畸形率显著相关(P＜0.05)，T23041C位点CC基因型是高精液量-高精子活率-低精子畸形率的优势基因型;SPATA4基因C3422A位点与精子畸形率、精子密度、精液PH值、体重及睾丸重显著相关(P＜0.05)，C3422A位点的AA基因型是高体重-高睾丸重的优势基因型，A3329C位点与睾丸重显著相关(P＜0.05);BSG基因C4294T与鸡冠重显著相关(P＜0.05);SPEE1基因G3399A、C5699T位点与体重显著相关(P＜0.05);P2X7基因A139G位点与精液量、精子畸形率、肉髯重显著相关(P＜0.05)，A139G位点的AA基因型是高精液量-低精子畸形率的优势基因型，C4184T、A10579G位点与精子活率显著相关(P＜0.05);ANXA7基因G6862A位点与精子密度显著相关(P＜0.05)，A13854T位点与精液量显著相关(P＜0.05)，G14234A位点与鸡冠重显著相关(P＜0.05);
　　 2、关联分析发现，SPAG6基因不同单倍型组合与精液量、精子畸形率显著相关(P＜0.05);H4H4单倍型组合精液量显著高于H2H3和H3H3组(P＜0.05)，精子畸形率显著低于H2H3和H3H3等组合(P＜0.05)。H4H4单倍型组合是高精液量-高精子活力-高精子活率-低精子畸形率的优势基因型，H2H3单倍型组合是鸡冠选育的有利单倍型组合。
　　 3、在睾丸组织中实时荧光定量PCR法检测发现:BSG，SEPP1，SPATA4与ANXA7基因的睾丸组织mRNA表达量在低精组中显著低于高精组和中精组(P＜0.05);而P2X7基因的mRNA表达量在高、中、低精组差异不显著(P＞0.05);SPAG6基因的mRNA表达量在高精组中显著高于中精组和低精组(P＜0.05)，在高精组睾丸组织中表达量高，该基因可能在种公鸡的精子发生过程中对确保精子头部的完整性起关键性作用。
　　 4、SPAG6，SPATA4基因可作为高精液品质鸡群筛选的主要候选基因。SPAG6基因的T23041C位点CC基因型和H4H4单倍型组合分别可作为高精液品质筛选的优势基因型和优势单倍型组合，PATA4基因的C3422A位点的AA基因型是种公鸡体重-睾丸重选择的优势基因型，辅助筛选高精液品质鸡群。

目录

论文说明

第一章 文献综述

1 动物育种研究进展

2 中国地方鸡选育现状

3 精液品质

3．1 精液品质的评价指标

3．2 精液品质的评定方法

3．3 精液品质的影响因素

4 精液品质研究进展

4．1 精液理化性质、化学组成以及形态结构特点

4．2 精液品质与繁殖力的关系

4．3 精液品质选择的现状

5 精液品质相关候选基因的研究

5．1 候选基因的分析方法

5．2 BSG基因研究进展

5．3 SEPP1基因研究进展

5．4 SPATA4基因研究进展

5．5 SPAG6基因研究进展

5．6 P2X7基因研究进展

5．7 ANXA7基因研究进展

6 荧光定量PCR技术

7 MALDI-TOF-MS(质谱)的检测技术

7．1 MALDI-TOF MS的检测原理

7．2 MALDI-TOF MS技术的应用

8 本研究目的意义

第二章 北京油鸡精液品质及性发育相关性状的候选基因的SNPs分析

1 材料与方法

1．1 试验动物和样品采集

1．2 主要仪器设备

1．3 主要试剂

1．4 精液品质测定

1．5 鸡血液DNA的提取

1．6 引物设计和PCR扩增

1．7 SNPs筛选与基因分型

1．8 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 PCR扩增结果及SNP检测

2．2 基因单位点不同基因型与性状关联分析

2．3 单倍型和单倍型组合频率

2．4 单倍型组合与精液品质相关性状的关联分析

2．5 单倍型组合与体重及性发育相关性状的关联分析

3 讨论

3．1 SPAG6，BSG，SEPP1，SPATA4基因多态性与精液品质及性发育性状关联性分析

3．2 P2X7，ANXA7基因多态性与精液品质及性发育相关性状关联性分析

4 本章小结

第三章 北京油鸡种公鸡精液品质相关候选基因的转录分析

1 试验材料

1．1 试验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂的配制

2 试验方法

2．1 鸡睾丸组织总RNA的提取

2．2 引物设计与合成

2．3 RT-PCR扩增

2．4 实时荧光定量PCR

2．5 数据处理与统计分析

3 结果与分析

3．1 总RNA的纯度与完整性

3．2 荧光定量PCR引物常规PCR检测及测序结果

3．3 荧光定量PCR的熔解曲线

3．4 候选基因mRNA表达结果

4 讨论

5 本章小结

全文结论

参考文献

致谢

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