禽病原性大肠杆菌E058株iucCiucD、iucD、iucDiutA基因突变株的构建及其致病性评价

摘要

禽大肠杆菌病(avian colibacillosis)指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(avianpathogenic Escherichia coli,APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎、全眼球炎、气囊炎、禽蜂窝织炎、肿头综合征、输卵管炎、滑膜炎及肺炎/卵黄囊感染等一系列病症。目前,该病已成为危害养禽业的重要细菌病,给养禽业带来严重威胁和造成重大经济损失。APEC有特定铁元素利用系统(specific iron assimilation system),这一系统由iucA、iucB、iucC、iucD及iutA5个基因编码的嗜铁体(siderophore)、气杆菌素(aerobactin)的合成和特定的外膜蛋白受体的表达两部分组成。本研究旨在探讨气杆菌素家族的iucC,iucD及iutA基因与致病性之间的关系,了解其突变株的生物学特性,为深入研究该病的致病机理和特异性防制措施奠定基础。
　　 运用Red重组系统构建E058iucCiucD、E058iucD、E058iucDiutA基因缺失突变株。同时将含iucD完整阅读框的pGEX-6p-1-iucD质粒电转化E058iucD突变株,构建E058iucD回复株ReE058iucD。
　　 Southern bbt结果显示Zeocin和Kanamycin抗性基因在E058iucCiucD,E058iucD或E058iucDiutA质粒中的插入是单拷贝的;RT-PCR结果表明E058iucCiucD的iucC,iucD基因不能转录,E058iucD的iucD基因不能转录,E058iucDiutA中iucD,iutA基因不能转录,而相关基因的上下游基因的转录并未受影响。Aerobactin产生试验中,E058iucCiucD,E058iucD和E058iucDiutA均不能产生Aerobaetin,而E058和Re-E058iucD均能产生Aerobactin。E058iucCiucD,E058iucD和E058iucDiutA的生长速度与E058相似。体外竞争试验表明,E058iucCiucD竞争指数(CI)值为O.97、E058iucD为0.75、E058iucDiutA为0.82。虽然突变株和野生株体外竞争结果变化不大,但在SPF鸡体内竞争试验中,E058iucCiucD与E058体内竞争24 h后心、肝、脾、肺、肾的CI值分别为0.80、0.30、0.36、0.39、0.50。E058iucD与E058体内竞争24 h后心、肝、脾、肺、肾的CI值分别为0.02、0.31、031、0.35、0.46。E058iucDiutA与E058体内竞争24 h后心、肝、脾、肺、肾的CI值分别为0.30、0.05、0.06、0.41、0.08。突变株各脏器的CI值在0.1～1之间,说明E058iucCiucD、E058iucD及E058iucDiutA与E058相比,均轻度致弱。体内动态分布试验中,E058iucCiucD攻毒24 h后在心、肝、脾、肺、肾分离到的细菌数(lg)分别为4.24±0.37、4.75±0.46、4.97±0.22、4.85±0.35、4.46±0.69。E058iucD攻毒后24 h在心、肝、脾、肺、肾中的细菌数(1g)分别为2.92±0.29、4.16±0.37、4.49±0.75、4.08±0.44、3.98±0.98。E058iucDiutA攻毒后24 h在心、肝、脾、肺、肾中的细菌数(lg)分别为3.89±1.12、4.68±0.91、4.54±0.64、4.77±0.97、3.74±2.17。而E058攻毒后24 h心、肝、脾、肺、肾分离到的细菌数(lg)分别为4.62±0.95、4.77±0.70、5.20±0.95、5.35±0.88、4.62±1.06。结果表明野生株E058的细菌载量明显高于E058iucCiucD、E058iucD、E058iucDiutA。E058、E058iucCiucD、E058iucD和E058iucDiutA株的半数致死量(LD50)分别为1044、1053、1048和104.7CFU,显示突变株的毒力有所下降。上述结果提示iucC、iucD及iutA基因与APEC E058株的致病性有一定的关联。