黔江烟区烟草青枯病生防细菌的筛选鉴定及其抑菌活性产物的研究

摘要

本试验以烟草青枯病病原菌为防治对象，对从黔江健康烟区烟草根际土壤中分离出的87株细菌进行直接对峙筛选初步筛选，获得2株对烟草青枯病菌有较好拮抗性的细菌5D15和5B18，通过全细胞脂肪酸分析和16SrDNA分析，鉴定了两株细菌的种属；然后优化了两株生防细菌的培养基组成，制备了2株细菌的发酵产物，通过滤纸片法对粗提物再次筛选，确定了2株细菌的发酵产物都能够抑制烟草青枯病病原菌；最后用薄层层析法确定了发酵产物的柱分离条件，对2株菌的发酵产物进行硅胶柱分离，通过核磁共振波谱法、质谱法和红外光谱法鉴定了活性物质的化学组成，为烟草青枯病生物防治的研究提供了参考。主要结论如下：
　　 (1)采用系列稀释法和平板涂布法，从黔江健康烟区土样中分离出87株细菌。直接对峙试验结果表明，细菌5D15和5B18对烟草青枯病病原菌有较好的拮抗作用，拮抗半径分别达到8.4mm和10.2mm。对两株细菌进行发酵，制备其发酵产物，配成25mg/mL的粗提物溶液，进行滤纸片法抑菌试验，结果显示，菌株5D15和5B18提取物的抑菌半径分别为6.2mm和8.0mm。
　　 (2)对5D15和5B18进行全细胞脂肪酸分析和16SrDNA分析，结果表明，5D15与铜绿假单孢菌亲缘关系最近，达到99.6％，5B18与芽孢杆菌亲缘关系最近，达到99.4％。
　　 (3)通过正交试验，优化了生防细菌5D15和5B18的培养基条件。对5D15的培养基设计了四因素五水平正交试验，发现氯化钠的浓度对5D15的生长影响最为显著，当氯化钠浓度为10.0g/mL时，5D15的生长情况最好。对5B18，首先比较了牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯葡萄糖培养基的影响，发现马铃薯葡萄糖培养基更适合5B18的生长，设计了三因素四水平正交试验，考察了马铃薯、葡萄糖和pH三种因素对5B18的影响。结果表明，马铃薯的浓度对5B18的生长速度影响最为显著，当马铃薯浓度为350g/L时，5B18生长条件最好。
　　 (4)将5D15的发酵产物初步分成极性不同的三部分：正己烷相、二氯甲烷相和甲醇相，滤纸片法活性测试结果显示，活性组分集中于二氯甲烷相。采用薄层层析法选择分离5D15活性产物的溶剂体系和溶剂比例，结果表明，二氯甲烷和甲醇体系适于5D15活性产物的分离，分离条件为甲醇含量分别为2％、4％、6％、10％和20％的梯度洗脱。对柱分离产物进行活性追踪，发现16～25号流出物对烟草青枯病病原菌有抑制活性，然后采用结晶法进一步纯化活性产物，高效液相色谱面积归一化法结果显示，活性产物含量为76.11％。采用MIC法测得纯化产物对烟草青枯病的半抑制浓度介于40～160μg/mL之间。核磁共振波谱分析和红外光谱分析结果表明，活性成分主要为环二肽-(酪氨酸-亮氨酸)。
　　 (5)将5B18的发酵产物初步分成极性不同的三部分：正己烷相、二氯甲烷相和甲醇相，滤纸片法活性测试结果显示，活性组分集中于二氯甲烷相和甲醇水相。采用薄层层析法选择分离5B18活性产物的溶剂体系和溶剂比例，结果表明，二氯甲烷和甲醇体系适于5D15二氯甲烷相的分离，分离条件为甲醇含量分别为4％、8％、12％和20％的梯度洗脱。对柱分离产物进行活性追踪，发现27号流出物对烟草青枯病病原菌有抑制活性，高效液相色谱分析结果显示，活性产物中主要含有13种组分。