体细胞核移植中供体细胞的准备与孤雌激活方法的研究

摘要

研究背景与目的:1997年，世界上首例体细胞克隆动物—“多莉”(Dolly)绵羊的诞生，标志着人类对哺乳动物体细胞核移植的研究翻开了新的一页。随后动物克隆成了世界范围内生物界研究的热点，但是目前总体来说体细胞核移植的成功率还很低，这主要是因为人们对核移植技术本身所蕴涵的规律还没有完全掌握，因此利用质优价廉的动物模型，如小鼠、大鼠、家兔等，加强核移植技术的基础研究具有十分重要的理论及现实意义。体细胞核移植作为一项动物克隆技术，它包含有核供体细胞的准备、受体细胞的准备、供体细胞与受体细胞质的融合、重构胚的激活、培养等多个技术环节，任何一个环节的失误都有可能对最终的结果产生很大的影响。本实验就体细胞核移植过程中供体细胞的准备以及卵母细胞孤雌激活这两个方面进行研究，旨在建立供体细胞体外培养体系、筛选出最优的供体细胞周期同步化和冻存复苏方法，以及通过卵母细胞孤雌激活方法的研究为核移植重构胚的激活提供必要的技术参数和实验数据，从而最终提高大动物体细胞核移植的成功率。
　　 研究内容与方法:(1)供体细胞体外培养体系的建立:以酶消化法从孕13.5天(d)的B6D2F1胎鼠中分离小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts，MEF)，并以2×107个/mL的密度接种于DMEM完全培养基进行培养，24h后首次换液，当细胞铺满瓶底80％～90％左右时，以2×105个/mL进行传代培养，借助传代和细胞优势的自然选择进行自然纯化。(2)MEF周期同步化方法的选择:取第三代汇合至70～80％的MEF进行G0/G1期同步化处理，实验中使用血清饥饿、接触抑制、Roscovitine作用这三种方法进行G0/G1期同步化处理，将同步化处理后的MEF用流式细胞仪进行细胞周期检测，并与未处理的对照组相比较，根据G0/G1期细胞占细胞总数的比例，最终筛选出MEF周期同步化的最优方法。(3)MEF冻存方法的筛选:取第三代汇合至70％～80％的MEF进行冻存处理，实验中选用DMSO为冻存保护剂，使用不同的DMSO浓度(5％、10％、15％)及不同的冻存程序进行细胞冻存，通过复苏后的细胞活力及24h贴壁率来检测冻存效果，从而得到最优的细胞冻存的方法。(4)卵母细胞孤雌激活方法的筛选:实验选用乙醇(Ethanol，EH)及氯化锶(SrC12)分别联合细胞松弛素B(Cytochalasin B，CB)作为孤雌激活剂，并从激活胚龄、激活剂浓度、激活时间三个方面对B6D2F1小鼠的卵母细胞进行孤雌激活，通过激活率以及激活后培养的卵裂率、囊胚形成率来检测激活效果，确定最优的卵母细胞孤雌激活程序。
　　 结果:(1)供体细胞体外培养体系的建立:将MEF接种于DMEM完全培养基中，原代培养约12h开始贴壁，胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形或不规则异形等形状，原代MEF中杂细胞较多，传代至第三代细胞得到自然纯化，杂细胞较少，细胞增殖迅速，排列有序，呈放射状或漩涡状排列。(2)MEF周期同步化方法的筛选:经流式细胞仪检测，以血清饥饿72h处理方法最优，其得到最高的G0/G1期细胞比例(87.19％)，与对照组及其他实验组相比有明显的优势。(3)MEF冻存方法的筛选:通过冻存复苏后细胞活力与24h贴壁率的比较，选用10％DMSO+10％FBS+80％DMEM-HG为冻存液，将冷冻管置于隔热的泡沫塑料盒中，在4℃下平衡两小时后放入-76℃冰箱中过夜，次日将冷冻管移入-196℃液氮中保存的冻存方式，可以得到最佳的细胞冻存效果（细胞活力:76.9％;24h贴壁率:70.8％），且MEF经复苏后细胞形态与冻存前未见明显差别，传代后细胞状态良好且保持很强的活力。(4)卵母细胞孤雌激活方法的研究:实验表明以10mmol/LSrCl2+CB作为激活剂，选用卵龄为18h的卵母细胞，并对其激活2h，可以得到较高的激活率(80.9％)，激活后的卵母细胞的状态较好，后续发育能力较强，得到的卵裂胚胎及囊胚较多质量也较好（卵裂率:56.1％;囊胚发生率:28.4％），部分囊胚经过继续培养还有继续孵出的能力。
　　 结论:以酶消化法得到的MEF能在DMEM完全培养基中稳定扩增，且在传三代后细胞较纯;第三代的MEF血清饥饿处理72h，可以使绝大部分细胞处于G0/G1期;使用10％DMSO作为冻存保护剂，采用适当的降温程序，可以得到较理想的冻存复苏结果;以10mmol/LSrCl2+CB作为激活剂，激活胚龄为18h的卵母细胞2h，是最优的孤雌激活程序。

目录

论文说明

符号说明

第一部分 综述

第二部分 研究内容

第一章 核移植供体细胞的分离培养、周期同步化与冻存

1 实验材料

2．实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 卵母细胞孤雌激活方法的研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

结论

致谢

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