大肠杆菌不耐热肠毒素突变蛋白的表达及其对粘膜免疫效果的影响

摘要

不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxin，LT)是由产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)产生的六聚体型蛋白，是引起人和动物腹泻的主要致病因子。因其具有很强的免疫原性以及能够辅助其他抗原通过粘膜免疫途径使机体产生特异性抗体，而被认为是良好的粘膜免疫佐剂，但因其具有较强的毒性而限制了LT在临床上的使用。因此，制备无毒而又保留佐剂活性的LT，将其开发为优秀的粘膜免疫佐剂，有着重要的医学价值和经济价值。
　　 为获得无毒且保留佐剂活性的LT蛋白，我们以产肠毒素大肠杆菌S462212株为材料，根据已发表的LT基因序列，设计了特异性引物，用重叠延伸PCR方法获对LT的A亚单位基因进行定点突变，成功将A亚单位第63位编码Ser的密码子(TCT)突变为编码Lys的密码子(AAA)，成功获得突变基因LTS63K，并将其克隆入原核表达载体pET-30a(+)中，在E.coliBL21中成功表达出约50KD的目的蛋白，与预期结果一致，表明重组菌pET-LTS63K构建成功，为研究其佐剂效应奠定了基础。
　　 相关研究表明，原核表达的CTLA-4胞外区具有靶向提呈抗原的功能，我们将LT突变蛋白与CTLA-4胞外区在大肠杆菌中融合表达以研究融合蛋白的免疫佐剂效应。将研究一中构建的LT突变基因片段，克隆入重组载体pET-CTLA-4IgV，获得重组表达质粒pET-CTLA-LTS63K，将其转化BL21(DE3)大肠杆菌。经IPTG诱导后，SDS-PAGE显示出预期约60KD的蛋白条带。Western-blotting结果显示，突变蛋白LTS63K和融合蛋白CTLA-LTS63K均能被LT抗血清识别，证明表达的重组蛋白具有较好的反应原性。
　　 为了研究突变体蛋白LTS63K与融合蛋白CTLA-LTS63K对灭活疫苗免疫效果的影响，用获得的蛋白溶液与禽流感灭活疫苗同时肌肉注射雏鸡。将160只7日龄健康非免疫雏鸡平均分为6组，第1、2组用不同剂量的LTS63K蛋白与疫苗同时免疫;第3、4组用不同剂量的CTLA-LTS63K融合蛋白与疫苗同时免疫;第5组只用疫苗免疫，不加蛋白;第6组为阴性对照组，不做任何处理。于首免后每隔7天采取血清样品和粘膜样品，分别测定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗体水平。结果显示，两种蛋白对灭活疫苗的佐剂效果不明显，与第5组检测结果无显著性差异。
　　 为了研究突变体蛋白LTS63K与融合蛋白CTLA-LTS63K对粘膜免疫的影响，我们用获得的蛋白溶液作为稀释液稀释IBDV弱毒疫苗，口服免疫雏鸡，3周龄加强免疫一次;将240只7日龄健康非免疫雏鸡平均分为8组，第1、2、3组的稀释液中含有不同剂量的LTS63K蛋白;第4、5、6组的稀释液中含有不同剂量的CTLA-LTS63K融合蛋白;第7组用生理盐水作为稀释液，不加蛋白;第8组为阴性对照组，不做任何处理。于首免后每隔7天采取血清样品和粘膜样品，分别测定血清中的IgG和粘膜分泌性IgA的抗体水平。结果显示，突变蛋白及融合蛋白通过粘膜免疫途径均能增强IBDV弱毒苗的免疫效果，提高血清IgG和粘膜IgA抗体水平。

目录

封面

英文摘要

符号说明

文献综述

1．大肠杆菌概述

2．LT的结构与性质

3．LT的粘膜免疫研究进展

4．LT突变体及其研究进展

研究一：大肠杆菌不耐热肠毒素突变蛋白的表达

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

研究二：LT突变蛋白与鸡CTLA-4胞外区的融合表达

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

研究三：LT突变蛋白及其融合蛋白对灭活苗免疫效果的影响

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

研究四：LT突变蛋白及融合蛋白对弱毒疫苗免疫效果的影响

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

结论

参考文献

致谢

声明