型雏鸭病毒性肝炎相关基因的筛选与验证

摘要

我国是鸭养殖和消费大国，但是随着养殖量的日益增加疾病也逐年增加并日趋复杂，尤其是育雏期饲养密度大且雏鸭的免疫功能尚未健全导致发病的机会增大，给水禽业造成巨大经济损失。Ⅰ型雏鸭肝炎主要侵染3周龄以内的雏鸭，传播迅速、发病急、传染性强、致死率高，死亡率可达50-90％。病毒感染机体以后，机体可以通过多种信号传导途径引起病毒与机体细胞基因表达的变化。但到目前为止，Ⅰ型雏鸭肝炎可引起鸭体内哪些基因表达的变化尚不清楚。因此寻找机体细胞中与病毒感染复制密切相关的基因，不仅有助于阐明病毒感染致病的分子机制，而且有利于为鸭抗病育种寻求新的基因资源。本研究以3日龄全同胞公金定鸭为试验材料，构建DHV-I感染雏鸭和未感染雏鸭的组织消减cDNA文库，以期从消减文库中筛选和鉴定差异表达cDNA片段，从而鉴定鸭对DHV-I感染的应答基因。具体结果如下:
　　 1、Ⅰ型雏鸭肝炎相关基因的筛选、鉴定和测序分析
　　 本试验建立了0.4ml肌肉注射Ⅰ型雏鸭肝炎病毒（扬州大学兽医学院彭大新教授馈赠）感染模型。感染组在24-48小时内集中死亡现象明显，绝大部分雏鸭死亡之前出现精神状态不佳，运动量减少，摇头、点头、背脖，全身痉挛性抽搐、两腿伸直和角弓反张等典型症状。剖检发现肝脏肿大，表面出现血点甚至血斑;肾脏充血、肿胀;脾脏肿大。以Ⅰ型雏鸭肝炎病毒RNA序列为基础设计引物，通过RT-PCR法检测DHV-I，感染组得到440bp的目的片段，对照组表现为阴性。
　　 抑制性消减杂交法成功筛选出全同胞金定鸭在人工感染DHV-I与同期注射等量生理盐水2种状态下差异表达的ESTs，并通过同位素点膜杂交法进行鉴定。对信号值差异在2倍以上的PCR产物测序得ESTs序列，所得ESTs在NCBI中进行BLAST比对，拟定Evalue＜e-10，matchlength＞150bp，matchrate＞80％的基因为其同源基因。利用Uniprot数据库，在线软件GO、KEGG对筛选出的ESTs进行功能注释和聚类分析。结果显示:正、反向文库各384个点杂交中分别筛选出符合条件的阳性克隆222个、77个。299个阳性克隆均测序得299个差异表达的ESTs，299个ESTs对应NCBI数据库中70个差异表达的基因，包括SPEN、WSB1、HSP90等52个上调表达基因和ALB、TLR6、TLR7等18个下调表达基因。聚类分析得筛选出的ESTs，12％与DNA复制合成相关，12％参与脂肪酸代谢，48％与药物、毒物、金属离子和吡哆醛磷酸盐等胁迫条件下异常生命调节活动相关，3％与蛋白质螯合相关，另25％参与生命体活动的其他调节作用。可以推测Ⅰ型雏鸭病毒性肝炎的发生和发展是多基因多步骤的复杂过程。差异基因在KEGG数据库中涉及的通路众多，多达69条。主要涉及代谢通路（Metabolicpathways，8条），内吞通路(Endocyticpathways，6条)，局灶性粘连通路(Focaladhesion，4条)，溶酶体通路（Lysosome，4条），ECM受体通路(ECM-receptorinteraction，3条)，乙醛酸和二羧酸代谢(Glyoxylateanddicarboxylatemetabolism，3条)，蛋白激酶信号通路（MAPKsignalingpathway，3条），细胞凋亡(Apoptosis，3条)和其他35条不同方面的通路。
　　 2、RT-PCR结合RACE法克隆ALB基因cDNA全长
　　 利用RT-PCR克隆筛选出的新基因(ALB基因)CDS区，同时利用RACE获得ALB基因cDNA全序列，测序结果显示:鸭ALB基因cDNA全长为2107bp，包括47bp的5'UTR，212bp的3'UTR，1848bp的ORF，其mRNA主要在肝脏表达。鸭ALB基因共编码615个氨基酸，比人、鼠、牛、猪和鸡分别多出9、8、9、10和1个氨基酸残基。氨基酸与鸡的同源性最高(85.4％)，其次是鼠(47.2％)、人(46.6％)、牛(46.6％)和猪(45.8％)。ALB基因氨基酸序列系统发育树显示，鸭和鸡聚为一类，亲缘关系最近;哺乳动物聚为另一类。其蛋白同源模建结果显示:ALB蛋白主要以α螺旋为主(66.02％)，其次是随机卷曲(25.37％)，延伸链(4.39％)和β转角(4.23％)。
　　 3、RT-qPCR和ELISA法检测部分差异表达基因
　　 利用RT-qPCR方法检测筛选出的ALB、TLR7（下调基因），PSPH、WSB1（上调基因）mRNA在易感组、抗性组和对照组胸腺、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑和腿肌中的表达量。结果表明:ALB基因在易感组和抗性组各组织中的表达量较对照组均显著下降(P＜0.01);抗性组与易感组相比小脑和腿肌ALB基因的表达量差异不显著(P＞0.05)，其他组织中该基因的表达量均极显著高于易感组(P＜0.01)。TLR7基因mRNA的表达规律与ALB相似。易感组各组织中PSPH和WSB1mRNA的表达量均极显著高于对照组和易感组(P＜0.01);总体来看，抗性组的肝、脾、肺、肾等组织的表达量与对照组相比差异显著或极显著(P＜0.05或者P＜0.01)，而其余组织表达量差异不显著(P＞0.05)。ELISA法测定ALB蛋白在上述各组织中的表达量显示:在肝，小脑和胸腺中，易感组中ALB蛋白的表达量极显著或显著低于对照组，高于抗病组(P＜0.05或者P＜0.01)。而在其他组织中，三处理组间差异不显著(P＞0.05)。血液生化指标的测定结果表明:感染组中谷丙转氨酶含量较对照组极显著升高(P＜0.01);尿素氮含量显著升高(P＜0.05);血液葡萄糖、IgG含量与对照组相比有一定量的下降，但差异不显著(P＞0.05);谷草转氨酶、甘油三酯、尿酸、IgA、IgM含量在发病时略微升高(P＞0.05)。

目录

论文说明

符号说明

第一章 文献综述

1 雏鸭病毒性肝炎概述及研究进展

1．1 雏鸭病毒性肝炎的研究现状

2 雏鸭肝炎相关基因研究进展

3 抑制消减杂交技术及其在疾病相关基因筛选中的应用

4 实时荧光定量PCR技术及其在疾病基因差异表达检测中的应用

5 本研究的目的、意义

第二章 试验研究

试验一：Ⅰ型雏鸭病毒性肝炎相关基因的筛选、鉴定和测序分析

1．材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

试验二：Ⅰ型雏鸭病毒性肝炎相关基因的克隆、表达和功能鉴定

1．材科与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢

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