细胞松驰素类化合物体外抗氧化活性及其构效关系初步研究

摘要

内生真菌（EndophytEC fungi）是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。内生真菌种类繁多，能产生结构多样的活性代谢产物，近年来已成为国内外资源开发利用的研究热点之一。 本文所研究的八种细胞松弛素（cytochalasin，Cyt）类化合物是从白茅内生菌球毛壳菌Chaetomium globosum IFB-WZQ和青皮内生菌拟茎点霉Phomopsis sp.IFB-E060固体发酵产物中分离获得的。分别是:chaetoglobosin F（编号WQ-1）、chaetoglobosin Fex(WQ-2)、chaetoglobosin E(WQ-3)、cytoglobosin A(WQ-4)、penochalasin C(WQ-6)、isochaetoglobosin D(WQ-9)、cytochalasin H(QS-1)和18-methoxycytochalasin J(QS-2)。它们都具有相似的氢化异吲哚-1-酮结构母核，在10位有吲哚或苯环取代。早期在对编号为QS-1化合物抗癌活性研究时，对其它活性也进行了筛选，发现该化合物具有较好的抗氧化活性，且对PC12细胞损伤有一定潜在的保护作用。查阅文献未见有类似的报道。鉴于该类化合物拥有相同的母核，其差异主要在母核和大环的取代基上。为此，本研究应用体外抗氧化模型、H2O2和MPP+损伤细胞模型，考察八种Cyt类化合物是否具有抗氧化活性？其活性强度与结构的关系如何？对自由基及神经毒素引起的细胞损伤是否具有保护作用？通过对该类化合物抗氧化活性构效关系规律的揭示，将为寻找具有强抗氧化活性的先导化合物提供实验资料，对植物内生菌这一新型药用资源的开发利用提供有益思路。主要实验结果如下: 1.清除自由基能力测定 方法:(1)DPPH自由基测定:采用微量比色法测定DPPH自由基吸光度，计算清除率。Cyt类化合物的浓度为10-6，10-5，10-4，10-3，10-2，10-1，5×10-1mmol/L，VE为阳性药。 (2)ABTS自由基测定:采用ABTS法微量比色测定ABTS自由基吸光度，计算清除率。以Trolox（维生素E的类似物）为标准对照，计算Trolox当量总抗氧化能力(TEAC)。Cyt类化合物的浓度为10-6，10-5，10-4，10-3，10-2mmol/L。 (3)应用SPSS17.0计算半抑制浓度(EC50)，反映药物的效价强度，Scott法计算最大效应(Emax)，反映药物的效能。采用单因素方差分析和SNK检验，进行抗氧化能力排序。 结果:(1)DPPH自由基清除能力:最大清除率Emax＞90％的有:WQ-9、QS-1和WQ-1; Emax=35％～60％: WQ-2、WQ-4、WQ-3和QS-2;通过对EC50和Emax统计分析，八种Cyt类化合物的抗氧化作用效价强度排序为:WQ-9=QS-1=WQ-1＞WQ-2＞WQ-4=WQ-3＞QS-2。效能排序与上述一致。WQ-6 EC50无法计算，无清除自由基能力。 (2)ABTS自由基清除能力:依据EC50，八种化合物清除ABTS自由基能力排序为:QS-1=WQ-9=WQ-1＞ WQ-2＞WQ-3＞QS-2＞WQ-4，WQ-6EC50无法计算;依据Emax，效能排序为:QS-1=WQ-9=WQ-1＞WQ-2=WQ-3=QS-2=WQ-4＞WQ-6。QS-1的TEAC最大，达到Trolox的746倍，其次是WQ-1和WQ-9为373倍，WQ-4最低为0.001倍，WQ-6无法计算。 结论:除WQ-6外，其余七种化合物均有不同程度的体外抗氧化活性，其中，QS-1、WQ-9和WQ-1活性最强。 2.抗H2O2损伤细胞作用研究 方法:通过对不同浓度(50～800μmol/L) H2O2作用不同时间(2，3，4，5，6h)考察，确定H2O2制备PC12细胞损伤模型条件。MTT法测定细胞存活率;比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性。分组:(1)对照组:含0.01％DMSO的DMEM溶液;(2)模型组:200μmol/L H2O2溶液;(3)阳性药物组:1000μmol/L VE溶液;(4)Cyt类化合物组:浓度为0.001，0.0025，0.005，0.01，0.05，0.1，0.2μmol/L。EC50(μmol/L)和Emax计算以及统计分析同上。 结果:(1)H2O2损伤PC12细胞模型:以200μmol/L H2O2溶液作用PC12细胞4h，细胞存活率为41.3％±3.6％(P＜0.001)，培养基上清液中LDH活性由对照组16.9±1.4U/dl上升为109.1±2.5U/dl(P＜0.05)。表明H2O2模型制备成功。 (2)细胞存活率:除WQ-6外，其它化合物均可提高细胞存活率，Emax＞90％的有:WQ-9、WQ-1和QS-1; Emax=73％～77％: WQ-2，WQ-4和WQ-3。QS-2虽也能提高细胞存活率(P＜0.01，0.001)，但没有量效关系，WQ-6则无效。经统计，效价强度排序为:WQ-1=QS-1=WQ-9＞WQ-4=WQ-2＞WQ-3，QS-2和WQ-6无法计算EC50。效能排序为:WQ-9=WQ-1=QS-1＞WQ-2=WQ-4=WQ-3＞QS-2＞WQ-6。 (3)LDH活性:除WQ-6外，与模型组109.1±2.5U/dl相比，其余七种化合物（0.005μmol/L）均可使LDH活性下降(P＜0.05，0.01)。经统计，LDH作用强度排序为:WQ-9=QS-1=WQ-1=WQ-2＞WQ-4=WQ-3=QS-2＞WQ-6。 结论:除WQ-6外，其余七种化合物均可不同程度地抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤，使细胞存活率提高，LDH释放减少。其中WQ-9，QS-1和WQ-1作用最强，WQ-2，WQ-4和WQ-3其次，QS-2无量效关系，WQ-6无效。 3.抗MPP+损伤细胞作用研究 方法:MTT法测定八种化合物细胞毒性，浓度分别为0.005，0.05，0.1，0.2，2.0，20μmol/L。应用500μmol/L MPP+作用PC12细胞48h制备MPP+细胞损伤模型。给药分组:(1)对照组:加含0.01％DMSO的DMEM溶液;(2)模型组:500μmol/L MPP+;(3)cyt类化合物组:浓度为0.005，0.01，0.025，0.05，0.1，0.15，0.2μmol/L。MTT法测定各组细胞OD值，计算细胞存活率;倒置显微镜观察细胞形态;比色法测定LDH活性;流式细胞仪测定ROS含量。EC50和Emax计算以及统计分析同上。 结果:(1)细胞毒性:八种化合物各浓度组细胞存活率均在90％以上，表明它们对PC12细胞增殖没有明显影响，无细胞毒性。 (2)细胞存活率:模型组细胞存活率明显降低(P＜0.001);QS-2不能抑制这种下降，WQ-6（0.005～0.05μmol/L）反增强抑制作用。其余化合物均能不同程度抑制细胞存活率的下降。效价排序为:WQ-1=WQ-9=QS-1＞WQ-2＞WQ-4＞WQ-3，WQ-6和QS-2 EC50无法计算。效能强度排序为:QS-1=WQ-1=WQ-9＞WQ-2=WQ-4=WQ-3＞WQ-6=QS-2。 (3)LDH活性:除WQ-6、QS-2和WQ-4外，与模型组134.987U/dl相比，其余5种化合物（0.025μmol/L）均可使LDH活性下降(P＜0.01，0.001)。经统计，作用强度顺序为:WQ-1=WQ-9=QS-1＞WQ-3=WQ-2＞WQ-4=QS-2＞WQ-6。 (4)细胞形态:对照组PC12细胞呈明显的梭形，MPP+模型组细胞形态显著改变，梭形细胞减少或消失，出现球形或圆形，八种化合物预处理后，WQ-1、WQ-2、WQ-9、QS-1能一定程度改善以上形态改变，其它4种化合物作用不明显。 (5)ROS含量比值:与对照组ROS比值为1比较，模型组ROS比值(13.13±0.11)极显著增高(P＜0.001)。除WQ-6、WQ-4和QS-2外，与模型组相比，WQ-1、WQ-9、QS-1、WQ-2和WQ-3能显著降低比值(P＜0.001，0.01)。作用强度顺序为:WQ-1＞WQ-9＞QS-1＞WQ-3＞WQ-2=WQ-4。 结论:除WQ-6和QS-2外，其余6种化合物均能不同程度的对抗MPP+诱导的细胞损伤，其中以WQ-1、WQ-9和QS-1作用最强，WQ-2、WQ-3和WQ-4次之。WQ-6不仅不能对抗MPP+诱导的细胞损伤，反有促进细胞损伤作用。 4.八种Cyt类化合物抗氧化作用构效关系分析 根据上述三个实验中各指标的EC50进行构效关系分析:(1)10-吲哚取代或10-苯基取代对抗氧化活性没有影响;(2)化合物抗氧化作用的强弱与结构中的羰基和羟基有关:21位的酯基比18位的甲氧基作用强;6，7位的环醚比醇羟基作用强;20位的羰基比醇羟基作用强;(3)大环内含有吡咯环时不仅无抗氧化活性，甚至可增加细胞损伤。

目录

摘要

符号说明

前言

第一部分 八种细胞松弛素类化合物自由基清除率的测定

前言

1 实验材料

2．实验方法

2．1 DPPH自由基清除率的测定

2．2 ABTS自由基清除率的测定

2．3 统计学检验

3．实验结果

3．1 对DPPH自由基的清除作用

3．2 对ABTS自由基的清除作用

4 讨论

小结

第二部分 八种细胞松弛素类化合物抗H2O2损伤细胞作用研究

前言

1．实验材料

2．实验方法

2．1 细胞培养

2．2 MTT法测定细胞存活率

2．3 八种Cyt类化合物对正常PC12细胞存活率的影响

2．4 H2O2制备PC12细胞损伤模型

2．5 实验分组与加药

2．6 LDH活性测定

2．7 统计学检验

3．实验结果

3．1 八种Cyt类化合物对正常PC12细胞存活率的影响

3．2 H2O2对PC12细胞存活率和LDH释放的影响

3．3 八种Cyt类化合物对H2O2模型细胞存活率的影响

3．4 八种Cyt类化合物抑制H2O2损伤细胞的半数有效浓度(EC50)和最大效应(Emax)

3．5 八种Cyt类化合物对H2O2模型细胞LDH释放的影响

4．讨论

小结

第三部分 八种细胞松弛素类化合物抗MPP+损伤细胞作用研究

前言

1 实验材料

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 MPP+制备PC12细胞损伤模型

2．3 八种Cyt类化合物对MPP+模型细胞存活率的影响

2．4 LDH活性测定

2．5 流式细胞仪测定细胞内ROS

2．6 统计学检验

3．实验结果

3．1 对MPP+模型细胞存活率的影晌

3．2 抑制MPP+损伤细胞的EC50和Emax

3．3 对MPP+模型细胞形态的影响

3．4 对Mpp+模型细胞LDH释放和细胞内ROS比值的影响

4 讨论

小结

第四部分 八种细胞松弛素类化合物抗氧化作用构效关系分析

1．10-吲哚取代或10-苯基取代对抗氧化活性的影响

2．10-苯基取代的细胞松弛素类构效关系分析

3．10-吲哚取代的细胞松弛素类构效关系分析

总讨论

总结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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