肠炎沙门氏菌鞭毛素fliC基因缺失突变株的构建及相关功能性分析

摘要

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, SE)是一大类革兰氏阴性(G-)无芽孢直杆菌，有鞭毛，能运动，为重要的人畜共患病原菌。肠炎沙门氏菌不仅使养禽业蒙受严重的经济损失，还是食源性重要病原菌。误食肠炎沙门氏菌感染禽蛋及禽肉制品能够引发人类的食物中毒，因此其在公共卫生学上也具有重要意义。肠炎沙门氏菌的致病性与其多种毒力因子关系紧密。通过不同的致病机制，肠炎沙门氏菌的毒力因子能够共同作用于宿主，造成宿主机体发病甚至死亡。在这肠炎沙门氏菌的多种毒力因子之中，鞭毛无疑是不容忽视的一种。沙门氏菌鞭毛作为沙门氏菌的主要运动器官，功能是辅助其完成有目的性的运动，典型如化学趋向性运动。但近十年来，沙门氏菌鞭毛与细菌生物被膜的形成及在诱导宿主机体发生免疫应答及炎症反应，尤其是其在致病过程中对宿主（小肠肠道粘膜等）的粘附定殖作用已逐渐引起了学术界的高度关注。本文以沙门氏菌鞭毛素基因fliC为研究对象，构建肠炎沙门氏菌野生株的鞭毛素fliC基因缺失株及在SEF14菌毛主要亚单位sefA缺失株的基础上构建菌毛鞭毛缺失株，继而通过体外细胞试验分析比较沙门氏菌鞭毛在肠炎沙门氏菌感染过程中侵袭、粘附作用及菌毛鞭毛之间可能存在的协同作用，以期揭示肠炎沙门氏菌与宿主之间相互作用的分子机制，为肠炎沙门氏菌临床上的防控提供可靠理论依据。 基于编码肠炎沙门氏菌鞭毛素fliC基因的已知序列，本试验利用λ噬菌体-Red同源重组系统对肠炎沙门氏菌的国内标准株CMCC(B)50336和国际标准株994fliC基因进行敲除。将含有fliC基因同源臂片段和Cat(氯霉素抗性基因)表达盒的PCR扩增产物，将其电转化至已经转化含有pKD46质粒的50336和994肠炎沙门氏菌中，借助Red同源重组酶作用，两端与靶基因两翼同源的序列可与染色体上相应区域发生重组，从而一步构建50336△fliC∷Cat和994△fliC∷Cat突变株。二次重组中，利用温度敏感性编码Flp重组酶的质粒pCP20，消除Cat抗性基因标志，得到二次重组菌50336△fliC和994△fliC，通过PCR鉴定及DNA测序结果证明上述缺失株的成功。按照上法在本实验室保存的SEF14菌毛亚单位缺失株50336△sefA、994△sefA的基础上构建了双缺失突变株50336△sefA△fliC和994△sefA△fliC株。将表达fliC基因的pBR322质粒转化入50336△fliC和994△fliC缺失株中，构建了相应互补株50336△fliC/pfliC和994△fliC/pfliC。在表型试验中，fliC缺失株在半固体培养基上缺乏运动性，电镜下观察呈无鞭毛形态且不能与肠炎沙门氏菌鞭毛单克隆抗体发生可见的凝集反应。上述缺失株及互补株的成功构建，为进一步深入研究鞭毛和SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌感染过程中的独立或协同作用，及如何有效控制肠炎沙门氏菌污染禽蛋产品奠定了一定的基础。 细菌生物被膜是细菌应对对其不利的生存环境一种生存方式，与处于浮游状态的单个细菌是两种截然不同的生活方式。许多致病菌可在一定的条件下形成生物被膜。在本试验中我们发现，肠炎沙门氏菌50336和994在体外均具有形成生物被膜的能力。鞭毛及鞭毛介导的运动性是影响生物被膜形成的重要因素之一，生物膜形成能力定性试验结果表明与野生株相比，鞭毛缺失株50336△fliC和994△fliC的生物膜形成大量减少，并且生物膜脆弱，而两者的回补株均能较好的恢复肠炎沙门氏菌生物被膜的形成。生物被膜定量试验进一步证明，鞭毛缺失后肠炎沙门菌形成生物膜的能力都显著下降。以上结果说明了鞭毛在肠炎沙门菌50336和994在体外生物被膜形成中起重要的作用。 细菌对肠道上皮细胞最初的粘附及后续的定植被认为在肠道疾病发病机制中作用关键。多种病原体对宿主细胞的粘附过程中，鞭毛均起重要介导作用。本研究通过比较肠炎沙门氏菌鞭毛缺失株、SEF14菌毛缺失株及鞭毛和SEF14菌毛双缺失株与野生株对人结肠腺癌细胞株Caco-2和猪上皮细胞IPEC-J2细胞的黏附能力后发现，鞭毛缺失株及鞭毛和SEF14菌毛双缺失株对Caco-2和IPEC-J2细胞系的黏附能力都显著下降(p＜0.05)，而SEF14菌毛缺失株的黏附能力并无明显的变化。说明鞭毛在肠炎沙门氏菌对宿主细胞的黏附过程中起重要作用，且鞭毛菌毛对宿主细胞的黏附作用起协同作用。

目录

摘要

符号说明

文献综述

肠炎沙门氏菌感染现状

沙门氏菌鞭毛结构及功能

沙门氏菌鞭毛隶属于粘附素大类

鞭毛运动性与毒力

鞭毛与细菌的生物膜形成

鞭毛与细菌的粘附和侵袭

Ⅲ型分泌系统结构和功能

沙门菌菌毛

沙门菌毛的分类

参考文献

研究一 肠炎沙门氏菌鞭毛主要编码基因fliC缺失突变株及相应回补株的构建

1 材料

1．1 菌株、抗体及质粒

1．2 培养基和主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 fliC基因缺失引物的设计

2．2 融合PCR产物的制备和纯化

2．3 感受态细胞的制备及转化

2．4 电转化

2．5 消除质粒pKD46

2．6 一次同源重组菌ΔfliC∷Cat的PCR鉴定

2．7 FLP位点专一性重组

2．8 第二次重组菌XΔfliC的鉴定

2．9 互补株的构建

2．10 半固体运动试验

2．11 负染和透射电镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)观察

2．12 玻板凝集试验

3 结果

3．1 融合PCR产物的制备

3．2 同源重组菌的PCR鉴定

3．4 鉴定引物P3、P4扩增XΔfliC菌株的序列分析

3．5 XΔfliC缺失株的表型分析

4 讨论

参考文献

研究二 鞭毛对肠炎沙门氏菌生物膜形成的影响分析

1 材料

1．1 菌株

1．2 培养基和主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 野生株、突变株与相应回补株生长曲线测定

2．2 结晶紫染色法定性测定野生株、缺失株与相应回补株生物膜形成

2．3 结晶紫染色法定量测定野生株、缺失株与相应回补株生物膜形成

3 结果

3．1 野生株、突变株与相应回补株生长曲线测定

3．2 野生株、缺失株与相应回补株生物膜形成能力定性分析

3．3 野生株、缺失株与相应回补株生物膜形成能力定量分析

4 讨论

参考文献

研究三 肠炎沙门氏菌鞭毛与肠上皮细胞Caco-2和IPEC-J2细胞的体外黏附作用

1 材料

1．1 菌株及细胞系

1．2 培养基和主要试剂

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 菌株的准备

2．2 Caco-2细胞粘附试验

2．3 IPEC-2细胞粘附试验

2．4 数据处理

3 结果

3．1 Caco-2细胞粘附试验

3．2 IPEC-2细胞粘附试验

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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