检测禽网状内皮组织增生症病毒的间接免疫荧光试验建立及应用

摘要

禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosisvirus，REV)感染可引起禽类的肿瘤、生长障碍和免疫抑制，导致禽类生产性能的降低以及疫苗免疫的失败，对养殖业的危害巨大。REV既可以水平传播，又能垂直传播，还能污染弱毒疫苗造成大范围的扩散。因此，有必要建立检测弱毒疫苗和临床样品中REV的方法。 本研究采用PCR方法扩增编码REV群特异性抗原p30的基因，分别克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1和pET-32a(+)。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导分别获得49kD和43.4kD的重组蛋白GST-p30与His-p30，经高亲和力的GST树脂和NI-NTA树脂纯化，以纯化的重组蛋白GST-p30免疫BALB/c小鼠制备脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合;以纯化的重组蛋白His-p30作为ELISA检测抗原筛选阳性克隆，经3-4次亚克隆，共获得8株可稳定分泌针对p30抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A10、2G1、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2。经鉴定这8株单抗的ELISA效价可达1∶6，400～1∶204，800;单抗4D9和4G2的亚类为IgG3，其余6株单抗的亚类均为IgG1;Westem-blotting结果显示单抗2G1、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2可与重组蛋白His-p30特异性反应;而单抗1AI0、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2则可与感染REV的DF1细胞产生特异性荧光。选取特异性和灵敏度都较高的单抗4D9进行纯化，并以此建立了检测REV的间接免疫荧光(IFA)试验。通过对IFA反应条件的优化，该IFA方法可有效检测出DF1细胞中感染的REV,与禽白血病病毒和马立克氏病病毒则不产生交叉反应;对REV的最小检出量为1TCID50，即1TCID50的REV感染DF1细胞4天后即可检出;而12.5TCID50的REV感染DF1细胞24h后即可检出;与PCR方法检测结果的符合率可达100％。 利用所建立的IFA方法对2011-2014年间江苏、山东、安徽、河北和北京等地送检的弱毒疫苗和临床样品进行检测。从120份弱毒疫苗样品中检出1株REV，而从300份临床样品中检到2株REV。对分离的3株REV进行gp90基因遗传进化分析，发现均为Ⅰ型的毒株，与标准株REV-A、REV-T以及HA9901的亲缘关系都很近，均在同一分支内。

目录

摘要

符号说明

综述 禽网状内皮组织增生症的病原特点和检测技术

1．病原特点

1．1 基因组结构

1．2 主要功能蛋白

1．3 病毒复制

1．4 传播方式

2．检测技术

2．1 聚合酶链反应(PCR)

2．2 DNA斑点杂交(Dot-blot)

2．3 环介导等温扩增法(LAMP)

2．4 实时荧光定量PCR

2．5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

2．6 间接免疫荧光试验(IFA)

检测禽网状内皮组织增生症病毒的间接免疫荧光试验建立及应用

1．材料

1．1 毒株、细胞系和实验动物

1．2 菌株、载体

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器设备

1．5 疫苗样品

1．6 病料样品

2．方法

2．1 p30蛋白的原核表达和纯化

2．2 针对REV p30蛋白单克隆抗体的制备

2．3 单克隆抗体的鉴定

2．4 检测REV的IFA方法最佳工作条件的优化

2．5 弱毒疫苗中REV的检测

2．6 病料中REV的检测

2．7 REV分离株的遗传进化分析

3．结果

3．1 REV p30蛋白的原核表达及纯化

3．2 单克隆抗体的制备

3．3 检测REV的IFA方法条件优化

3．4 临床样品中REV的检测

3．5 REV分离株的遗传进化分析

4．讨论

全文总结

参考文献

致谢

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