多基因聚合的高赖氨酸转基因水稻的选育及评价

摘要

水稻是最重要的粮食作物之一，是世界半数人口赖以生存的主要食物;也是我国第一大粮食作物，面积约占全国粮食作物总面积的30％，其总产约占粮食总产量的40％。随着生活水平的提高人们对稻米营养品质也越来越关注，衡量稻米营养品质的指标主要是稻米中蛋白质和氨基酸组成，而水稻种子中蛋白质含量仅占粒重的5～10％，赖氨酸仅占蛋白质的3.5～4.0％，是第一限制性必需氨基酸。因此，提高水稻赖氨酸含量一直是水稻育种家追求的主要目标之一。 本实验室在前期通过基因工程手段对水稻中赖氨酸合成和降解途径分支点上关键酶的表达进行调控，达到了提高稻米中游离赖氨酸含量的目的，也成功获得了相应的转基因水稻纯合系，并在此基础上通过杂交聚合方式获得了不同基因聚合的转基因水稻纯合自交系。本研究以这些转基因及其基因聚合系为材料，进行了基因表达、赖氨酸含量、稻米外观品质和理化品质等方面的分析，以为后期高赖氨酸水稻的选育和利用奠定基础。主要研究结果如下: 1、转基因水稻纯合系以及聚合系的选育。通过几年的努力，本实验室已经获得了以武香粳9号为受体的含不同外源基因(AK、DHPS、LKR-RNAi)的系列转基因水稻纯合系，如:GR-65、GR-14、35S-15等，在此基础上，本研究为了探究进一步提高转基因稻米中赖氨酸含量的方法，将转基因水稻纯合系35S-15分别与GR-65、GR-14进行杂交配组选育，经过多代筛选，获得纯合的聚合基因系35S-15/GR-14、GR-65/35S-15等。以武香粳9号为受体的系列转基因水稻聚合基因系和抗条武育粳3号为亲本进行杂交，筛选杂交后代，获得抗条纹叶枯病的纯合转基因系RWY3/(35S-15/GR-14)和RWY3/(GR-65/35S-15)。 2、转基因水稻叶片和胚乳中目的基因的表达分析。导入赖氨酸合成途径中的关键基因AK和DHPS的转基因水稻中，AK和DHPS的相对表达量都很高。当LKR/SDH RNAi结构整合进水稻后，胚乳中内源LKR/SDH基因的表达受到明显抑制。 3、转基因水稻成熟种子中赖氨酸含量的变化。测定结果表明，转基因水稻成熟种子中游离赖氨酸含量较未转化对照有不同程度的增加。聚合基因系35S-15/GR-14和35S-15/GR-65都提高了20倍左右，总赖氨酸含量也有所上升。与抗条武育粳3号相比，杂交后代聚合基因系35S-15/GR-14中赖氨酸含量提高尤为显著，达到20-50倍。 4、高赖氨酸转基因水稻理化品质的变化。聚合基因系米粒表面颜色变暗，垩白率增加;精米蛋白含量有显著的增加。转基因稻米中的赖氨酸含量提高后，直链淀粉含量和未转化对照相比，均有所下降。大部分游离赖氨酸含量明显提高的水稻成熟种子中，峰值粘度(PKV)、热浆粘度(HPV)、消减值(SBV)和冷胶粘度(CPV)和未转化亲本相比都有着极显著的下降，而崩解值(BDV)、峰值时间(PeT)和起浆温度(PaT)没有显著变化。 5、转基因水稻田间农艺性状调查。测定结果表明，转基因水稻与未转化相比千粒重、主穗长、株高都有显著或极显著的变化。GR-65、GR-14纯合系的千粒重与亲本相比有所增加，而35S-15的千粒重有着极显著的减少，聚合基因系的千粒重与未转化相比有明显减少;而有效分蘖数、结实率与未转化亲本相比没有明显的变化。

目录

摘要

符号说明

1 文献综述

1．1 必需氨基酸

1．2 赖氨酸的作用和营养价值

1．3 植物中赖氨酸的生物合成与分解代谢

1．3．1 天冬氨酸的代谢途径

1．3．2 赖氨酸分解代谢途径

1．4 代谢工程提高植物中赖氨酸含量的研究进展

1．4．1 增加赖氨酸的生物合成

1．4．2 降低赖氨酸的分解调控

1．4．3 在增加赖氨酸合成同时减少赖氨酸分解

1．5 提高赖氨酸含量后的连带效应

1．6 本研究目的及其意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 杂交选育

2．1．3 PCR引物

2．1．4 生化试剂和仪器

2．2 叶片潮霉素抗性检测

2．3 PCR的分析

2．3．1 水稻叶片总DNA的提取

2．3．2 PCR的扩增

2．4 半定量RT-PCR

2．4．1 水稻叶片中总RNA提取

2．4．2 水稻胚乳中总RNA提取

2．4．3 反转录获得第一链cDNA

2．4．4 半定量RT-PCR

2．5 实时荧光定量PCR

2．6 稻米样品前处理

2．7 种子氨基酸含量的分析

2．7．1 稻米中总氨基酸含量的测定

2．7．2 稻米中游离氨基酸含量的测定

2．8 稻米理化品质性状的测定

2．8．1 糊化温度的测定

2．8．2 直链淀粉含量的测定

2．8．3 胶稠度的测定

2．8．4 淀粉粘滞性谱(RVA)的测定

2．8．5 种子蛋白质含量的测定

2．8．6 凯氏定氮法测定蛋白质含量

2．8．7 淀粉的提取

2．9 田间性状调查

3 结果与分析

3．1 转基因水稻聚合系的选育

3．2 目的基因在转基因水稻中的表达分析

3．2．1 目的基因在转基因水稻叶片中的表达

3．2．2 目的基因在转基因水稻胚乳中的表达

3．3 转基因稻米中赖氨酸含量的测定

3．4 转基因稻米中其他氨基酸和蛋白质含量的变化

3．4．1 总氨基酸含量和总蛋白质含量的变化

3．4．2 对种子中其他氨基酸含量的影响

3．5 转基因水稻成熟种子的外观品质

3．6 转基因稻米的理化品质

3．6．1 常规理化品质的测定

3．6．2 转基因稻米米粉的RVA谱

3．6．3 转基因稻米淀粉的RVA谱

3．7 转基因水稻的田间农艺性状

3．8 抗条纹叶枯病高赖氨酸含量转基因系的选育

3．8．1 抗条转基因稻米赖氨酸含量的测定

3．8．2 抗条转基因稻米中其他氨基酸的变化

3．8．3 抗条转基因稻米的理化品质

3．8．4 抗条转基因水稻田间农艺性状

4 小结与讨论

4．1 研究小结

4．2 外源AK、DHPS、LKR／SDH RNAi在转基因水稻种子中的表达

4．3 进一步提高游离赖氨酸含量的策略分析

4．4 提高赖氨酸含量对稻米其它品质性状的影响

4．5 赖氨酸富集带来的连带效应及其成因探讨

4．6 展望

参考文献

致谢

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