Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立

摘要

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染引起的病毒性肝炎症，具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征，其临床症状与甲型肝炎相似。急性戊型肝炎患者一般发病期为3至4周左右，期间除了体内转氨酶水平升高之外，一般不产生明显的并发症。但研究也表明，急性戊型肝炎对孕妇具有威胁。孕妇在妊娠期内，感染急性戊型肝炎的概率要大于其他人群，因其导致的流产率接近20％。免疫力低下的患者感染HEV后能够发展为慢性戊型肝炎。有些慢性戊型肝患者因肝脏快速纤维化而出现肝硬化，并最终导致肝功能衰退甚至肝脏衰竭。 现有的研究已发现，戊型肝炎病毒共分为4种基因型，其中Ⅳ型HEV能普遍感染人和牲畜，在卫生条件差或饮水问题严重的地区极易大规模爆发和流行，对社会造成巨大和健康隐患和经济损失。为了对Ⅳ型HEV更好的进行检测和生物学活性研究，本文做了两方面的研究: 研究一根据GenBank收录的多株Ⅳ型猪HEV ORF2保守基因序列，设计一对特异性引物，建立起一套Ⅳ型HEV SYBR Green Real-time RT-PCR方法，并对其稳定性，特异性及灵敏度做了相关分析，同时与常规的巢式PCR(或称nested-RT-PCR)进行比较。结果显示，建立的标准曲线相关系数(R2)、组内重复性Ct值变异系数(CV％)和组间重复性Ct值变异系数(CV％)均符合要求，显示该方法具有良好的稳定性。且与传统的巢式PCR相比，本研究所建立的荧光定量PCR方法能更好的运用于对Ⅳ型猪HEV的检测和定量研究。 研究二为获得单一的、高纯度的Ⅳ型猪HEV病毒液，本研究将猪戊型肝炎急性期内的Ⅳ型HEV阳性粪便悬液经快速离心和过滤后感染人肝癌细胞(smmc-7721)，进行病毒毒株的纯化与扩增，成功的建立起一套稳定的Ⅳ型猪HEV体外细胞培养体系。接种阳性粪便悬液的细胞在接毒后发生大量凋亡并裂解，并发现人肝癌smmc-7721细胞系支持Ⅳ型猪HEV的增值。对不同初始病毒接种量下HEV的增值趋势分析显示，在一定条件和范围内，HEV初始接种量越大，病毒的增值速度越快，增值效率也越高。此外对Ⅳ型猪HEV毒株进行了7次持续的传代培养，细胞上清液中HEV的拷贝量最高可在接毒后第72天增值至2.05×107copies/mL。与传统的HEV体外细胞培养体系相比，本研究根据人肝癌smmc-7721细胞所建立的体外培养体系能更好的应用于对Ⅳ型猪HEV进行大量的、持续的培养。 通过本研究，初步构建起一套较为稳定的Ⅳ型猪HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系，能在检测对Ⅳ型猪HEV进行检测的同时，对HEV在smmc-7721细胞中的增值进行较为准确的定量。本研究对戊型肝炎的检测与防治具有积极的意义，也利于对在分子水平对HEV展开进一步的研究。

目录

摘要

符号说明

综述 戊型肝炎病毒概述及分子流行性病学研究进展

1 HEV的特征

2 HEV基因型和亚基因型的基因差异

3 HEV的进化史

4 戊型肝炎在世界范围内的分布情况

5 不同传播环境下各HEV毒株的基因相关性

6 不同区域人源与猪源HEV的基因相关性

7 人源HEV和猪源HEV的基因差异

8 人畜共患HEV的潜在人类传染源

9 感染HEV人群的实际数量

10 戊型肝炎的检测和防治

11 讨论

研究1 Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测方法的建立

1 材料

1．1 病毒毒株

1．2 主要仪器

1．3 工具酶和试剂

1．4 菌种和克隆载体

1．5 所用培养基和溶液

2 方法

2．1 引物设计

2．2 病毒RNA的提取

2．3 目的基因的RT-PCR体系

2．4 标准质粒的构建

2．5 Real-time RT-PCR反应体系的建立

3 结果与分析

3．1 RT-PCR产物大小及测序结果

3．2 标准质粒浓度测定

3．3 标准曲线的建立

3．4 Real-time RT-PCR方法的重复性分析

3．5 Real-time RT-PCR方法与常规nested-RT-PCR方法的比较分析

3．6 Real-time RT-PCR方法的特异性分析

4 讨论

研究2 Ⅳ型猪源HEV体外细胞培养体系的建立

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 对细胞病变(CPE)的观察

2．2 对病毒培养物HEV RNA的nested-RT-PCR检测

2．3 对不同初始病毒接种量下HEV的增值趋势分析

2．4 病毒的传代培养

3 讨论

总结

参考文献

致谢

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