梨果实香气成分生物合成相关基因的克隆与表达分析

摘要

梨(Pyrus spp)是深受国内外消费者喜爱的水果之一，在我国栽培历史悠久，具有很高的营养价值和保健作用。果实香气是果实品质的重要指标，也是吸引消费者和增强市场竞争力的主要因素之一。本文首先分析了我国部分砂梨和秋子梨品种果实香气成分的种类及含量，挖掘出了果实香气浓郁的特异资源，在此基础上，以挖掘出的香气浓郁的砂梨品种‘金二十世纪’（Pyrus pyrifolia‘Jinershishiji’）和秋子梨品种‘南果梨’（Pyrusussuriensis‘Nanguoli’）为试材，分别克隆了梨主要果实香气成分生物合成相关的醇酰基转移酶(PpAAT)和α-法尼烯合成酶(PuFS)基因，并分析了两个基因在果实不同发育时期和不同部位的时空表达规律。主要研究结果如下: 1、以商熟期的7个秋子梨和6个砂梨品种为试材，采用顶空固相微萃取结合GC-MS，分析比较了其果实芳香成分的种类及含量，结果表明，(1)7个品种的果实中分别鉴定出10、22、25、19、16、26和25种香气成分，包括醛类、酯类、醇类和烯烃类化合物，但含量高低有明显差异。‘荣香’、‘龙香’、‘香水’和‘晚香’的主要香气成分为醛类物质，‘南果’、‘大南果’和‘寒香’梨主要香气成分为酯类物质。在‘南果’梨中还检测出了较高含量的α-法尼烯，而在其它品种中α-法尼烯相对含量很低或未检测到。(2)6个砂梨品种商熟期果实中分别鉴定出21、15、17、23、19和18种香气成分，除‘金二十世纪’外，其余5个品种相对含量最高的均为清香型的己醛，‘金二十世纪’相对含量最高的成分为浓香型的己酸乙酯。(3)进一步以‘二十世纪’及其芽变品种‘金二十世纪’为试材，研究了其果实不同发育时期（绿熟期、商熟期和完熟期）果实香气成分的差异。综合分析发现，‘二十世纪’绿熟期、商熟期和完熟期果实的主要香气成分均为己醛，‘金二十世纪’绿熟期果实的主要香气成分同样是己醛，但商熟期果实中己酸乙酯的含量迅速增加，成为主要香气成分，完熟期时含量进一步增加，这可能也是其具有浓郁香气的主要原因。 2、分别以‘金二十世纪’和‘南果梨’商熟期果实为试材，采用CTAB法提取其总RNA，并利用RACE法分别克隆得到了果实香气成分合成相关的醇酰基转移酶基因PpAAT和α-法尼烯合成酶基因PuFS的全长序列。PpAAT基因cDNA全长1648bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框(1316bp)、5'非编码区(79bp)、终止密码子、3'非编码区(242bp)和poly(A)尾巴(11bp)，共编码473个氨基酸。该基因登录号为KF887152; PuFS基因cDNA全长1505bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框(1240bp)、5'非编码区(145bp)、终止密码子、3'非编码区(104bp)和poly(A)尾巴(11bp)，共编码460个氨基酸。该基因登录号为KF887153。 3、分别以‘金二十世纪’和‘南果梨’为试材，采用半定量PCR(RT-PCR)技术研究了Pp AAT和PuFS基因在梨果实不同发育时期及不同部位中的时空表达规律，分析了酯类物质和α-法尼烯积累与目的基因表达之间的关系，结果表明:(1)随着果实的成熟，PpAAT基因在‘金二十世纪’果皮中的表达量呈逐渐下降的趋势，绿熟期表达量最高，商熟期表达量开始降低，完熟期表达量非常弱;PpAAT在果肉中的表达量呈先升高后降低的趋势，在商熟期果肉中表达量最高，绿熟期果肉中次之，完熟期果肉中的表达量最低。总体上，PpAAT基因在商熟期的表达量高于绿熟期和完熟期，在果皮中的表达量高于果肉。(2)随着果实的成熟，PuFS基因在‘南果梨’果皮中的表达量呈逐渐下降的趋势，绿熟期表达量最高，商熟期表达量开始降低，完熟期表达量非常弱。而PuFS在3个时期果肉中的表达量均很弱，且差异不明显。总体上，PuFS基因在绿熟期的表达量高于商熟期和完熟期，在果皮中的表达量显著高于果肉。

目录

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 梨概述

1．1 梨种质资源

1．2 梨的营养和药用价值

1．3 梨果实芳香物质研究

2 植物次生代谢途径的研究

2．1 酚类物质及其合成途径

2．2 含氮化合物及其合成途径

2．3 萜类物质及其合成途径

2．4 果实芳香物质的生物合成与代谢研究

3 本研究的目的和意义

第二章 不同梨种质资源果实香气成分与含量的比较分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2．结果与分析

2．1 7个秋子梨品种果实香气成分分析

2．2 6个砂梨品种果实的香气成分分析

2．3 ‘二十世纪’和‘金二十世纪’不同发育时期果实香气成分分析

3 讨论

第三章 梨果实香气成分生物合成相关PpAAT和PuFS基因的克隆

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 PpAAT基因的3’和5’端cDNA片段的克隆

2．2 PpAAT基因全长cDNA序列及其分析

2．3 PuFS基因3’和5’端cDNA片段的克隆

2．4 PuFS基因全长cDNA序列及其分析

3 讨论

第四章 梨PpAAT和PuFS基因的时空表达分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．1 PpAAT在‘金二十世纪’梨果实不同发育时期及不同部位中的表达分析

2．2 PuFS在‘南果’梨果实不同发育时期及不同部位中的表达分析

3 讨论

参考文献

致谢

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