京海黄鸡柔嫩艾美耳球虫感染后盲肠转录组分析及其杂交配套系亲本的抗性评价

摘要

鸡球虫病是由一类寄生于鸡肠道内的寄生原虫所引起的疾病，以雏鸡高死亡率和出血性肠炎为主要特征。特别是鸡柔嫩艾美耳球虫病（E.tenella）在雏禽3周龄至2月龄时最易感染，发病率高达50％-70％，对我国养禽业造成了巨大的危害。本研究一方面为了寻找与鸡E.tenella抗性有关的关键基因和关键通路，以京海黄鸡为试验动物，在30日龄时高剂量感染柔嫩艾美耳球虫，采用RNA-seq技术分析感染后第8天感染鸡和非感染对照鸡盲肠组织的基因组表达水平，对部分差异基因通过qRT-PCR进行了验证，并对差异基因进行了GO、KEGG富集分析。另一方面为了探明京海黄鸡配套系亲本的球虫抗性，研究分别对配套系亲本进行了高剂量E.tenella感染、球虫疫苗免疫和疫苗免疫后高剂量E.tenella感染3个试验，采用存活率、体增重、卵囊脱落数、盲肠记分、抗球虫指数(ACI)等评价指标及一氧化氮(NO)、过氧化氢(CAT)、γ干扰素（IFN-γ）等10项血浆指标对其杂交配套系亲本BB、FF、WW对E.tenella抗性及球虫疫苗免疫后的免疫效果进行了评价。研究结果如下:
　　1.转录组测序结果表明，鸡E.tenella感染组与对照组共有5477个表达差异显著的基因（Padj＜0.05），其中上调基因有2942个，下调基因有2535个。选取10个差异基因进行qRT-PCR验证，结果表明差异基因的表达倍数与RNA-seq的结果基本一致，说明试验结果真实可靠。
　　2.GO和KEGG通路的富集分析表明差异基因主要与脂类代谢、细胞交流、炎症应答、免疫/防御、血管生成、信号转导等有关。鸡在应答E.tenella感染的过程中，机体产生了复杂的免疫应答，涉及黏着斑、细胞因子-受体相互作用、过氧化物酶体、细胞外基质-受体相互作用、过氧化物酶体增殖物激活受体等信号通路。这些通路中的关键差异基因有FAK、TGFB2、TGFB3、IL-6、IL-15、CD36等，这些基因均在宿主抵抗球虫感染过程中发挥重要作用。
　　3.京海黄鸡杂交配套系亲本BB、FF、WW鸡在30日龄时高剂量感染E.tenella，感染后8天检测各项评价指标。其中WW感染组抗球虫指数(ACI)值最高为143.1，BB感染组ACI值为142.6，两者均为抗球虫低效，FF感染组ACI值最低为119.3，为抗球虫无效:ACI值与过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素17(IL-17)和干扰素-γ（IFN-γ）4个免疫指标相关显著(P＜0.05); BB感染组NO、白介素2(IL-2)、IL-17、SOD含量显著高于FF感染组(P＜0.05)。综合分析表明:京海黄鸡杂交配套亲本BB鸡对E.tenella抗性显著高于FF鸡，略高于WW鸡。
　　4.京海黄鸡杂交配套系亲本BB、FF鸡在9日龄时经正典球虫四价活疫苗免疫，免疫后8天检测各项评价指标。其中BB鸡免疫组CAT、SOD和IL-17的含量显著高于FF鸡免疫组(P＜0.05);BB免疫组CAT和SOD含量显著高于非免疫对照组(P＜0.05); FF免疫组CAT和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量均显著高于对照组(P＜0.05)。综合分析结果表明BB鸡免疫效果优于FF鸡群体，BB鸡E.tenella抗性优于FF鸡群体。
　　5.京海黄鸡杂交配套系亲本BB、FF鸡在9日龄用两种球虫疫苗免疫，免疫后24天进行高剂量感染E.tenella，感染后8天检测各项指标。综合临床表现、盲肠病变、相对增重率及ACI，发现BB鸡群体E.tenella抗性优于FF鸡群体，免疫1组（500个活卵囊）优于免疫2组（正典球虫疫苗）;CAT、SOD的含量免疫1组鸡均显著高于免疫2组鸡(P＜0.05);BB鸡中，IFN-γ含量免疫1组鸡显著高于免疫2组鸡(P＜0.05);FF鸡中，β胡萝卜素(β-C)含量免疫1组鸡显著高于免疫2组鸡(P＜0.05)。综合分析表明，500个E.tenella活卵囊免疫效果优于正典球虫疫苗，BB鸡群体E.tenella抗性优于FF群体。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 京海黄鸡及其杂交配套系亲本

2 鸡球虫病

2．1 鸡球虫的生活史

2．2 鸡球虫病发病机制

2．3 鸡球虫病的危害

2．2 鸡球虫病的防治现状及趋势

3 鸡球虫病抗性相关评价指标

3．1 干扰素

3．2 白细胞介素

3．3 一氧化氮

3．4 β-胡萝卜素

3．5 抗氧化系统酶

4 不同品种(系)鸡球虫病抗性的遗传差异性

5 转录组测序技术的应用

6 本论文研究的目的意义

第二章 京海黄鸡感染柔嫩艾美耳球虫后盲肠转录组差异基因功能和通路分析

1 材料与方法

1．1 试验动物和病原

1．2 试验动物的分组

1．3 总RNA提取及检测

1．4 文库构建及转录组测序

1．5 原始数据统计分析及差异表达基因的筛选

1．6 差异表达基因的GO和KEGG分析

1．7 荧光定量验证差异表达基因

2 结果与分析

2．1 RNA-Seq数据的结果与分析

2．2 差异表达基因的筛选与鉴定

2．3 GO的富集及KEGG代谢通路分析

2．4 荧光定量PCR验证

3 讨论

3．1 RNA-Seq技术用于挖掘鸡球虫相关功能基因的优点

3．2 E．tenella感染后主要差异表达基因的功能和通路分析

第三章 京海黄鸡杂交配套系亲本柔嫩艾美耳球虫敏感性比较研究

1 材料与方法

1．1 试验动物和病原

1．2 主要仪器设备与型号

1．3 试验动物的分组

1．4 存活率和相对增重率的测定

1．5 血便扣分、病变值和卵囊值的测定

1．6 抗球虫指数(ACI)的测定

1．7 血浆抗性指标的测定

1．8 统计分析

2 结果与分析

2．1 经E．tenella孢子化卵囊感染后各组临床症状和解剖特征比较

2．2 敏感性试验结果

2．3 ACI与各血浆指标相关性分析

2．4 不同组血浆各指标统计分析结果

3 讨论

3．1 BB、FF、WW敏感性比较

3．2 ACI与各血浆指标相关t陛分析

3．3 各感染组各血浆指标相关性分析

第四章 京海黄鸡杂交组合亲本球虫苗免疫后抗性指标比较研究

1 材料与方法

1．1 试验动物和球虫疫苗

1．2 主要仪器与型号

1．3 试验动物的分组与处理

1．4 抗性指标的检测和检测方法

1．5 统计分析

2 结果与分析

2．1 经活疫苗免疫后各组鸡临床表现

2．2 BB、FF两鸡群体各组血浆抗性指标的比较

2．3 BB鸡群体免疫组与对照组血浆抗性指标的比较

2．4 FF鸡群体免疫组与对照组血浆抗性指标的比较

3 讨论

3．1 BB、FF两鸡群体免疫组血浆抗性指标的比较

3．2 BB、FF鸡群体免疫组与对照组血浆抗性指标的比较

第五章 京海黄鸡杂交配套系亲本球虫苗免疫后柔嫩艾美耳球虫高剂量感染免疫效果的比较

1 材料和方法

1．1 虫株和虫苗

1．2 主要仪器与型号

1．3 试验动物的分组与处理

1．4 存活率和相对增重率的测定

1．5 病变值和卵囊值的测定

1．6 抗球虫指数(ACI)的测定

1．7 血浆抗性指标的测定

1．8 统计分析

2 结果与分析

2．1 经E．tenella孢子化卵囊感染后各组临床症状和解剖特征比较

2．2 敏感性试验结果

2．3 两鸡群体各免疫组的血浆免疫指标比较

2．4 各指标BB和FF间的比较结果

3 讨论

3．1 两鸡群体各免疫组对球虫敏感性的分析

3．2 各免疫组免疫指标的比较分析

第六章 全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

声明