脂肪酶及其固定化技术在典型无环单萜类乙酸酯香料制备中的应用研究

摘要

无环单萜类乙酸酯作为自然香精和香料的重要组成成分，现已广泛应用于食品、饮料、化妆品和医药等行业，具有巨大的应用价值。针对天然提取法的高成本和化学合成法的高污染、副产物多等问题，本论文利用非水相中的脂肪酶催化转酯化反应分别制备乙酸香茅酯和乙酸香叶酯两种典型的无环单萜类乙酸酯。其主要内容如下:
　　(1)乙酸香茅酯的制备及其动力学研究:首先对实验室现有的6种不同来源的游离脂肪酶进行筛选，确定1号脂肪酶为该反应的最佳实验用酶。进一步对反应条件进行优化，结果表明:以乙酸乙烯酯作为反应物兼溶剂时反应速度最快;反应温度为40℃;摇床转速达到200rpm后外扩散基本可以消除;酶量为9mg/mL;在此优化条件下，反应5h产率可达99％以上。底物浓度在500mmol/L以下时，未发现底物抑制现象，而实验结果显示产物抑制的影响不可忽略。对该脂肪酶的重复利用性的研究显示，第2次重复使用该脂肪酶时，产率就降为原来的55.57％，这表明该脂肪酶的稳定性还有待提高。在此基础上，对该无溶剂体系中脂肪酶催化转酯化反应合成乙酸香茅酯的反应动力学进行了研究，结果显示该反应为一个存在产物抑制的乒乓双-双反应机制。其反应速度方程如下:
　　V=Vm[B]/KA+KB+KQA(1+[Q]KIQ)[Q]+KBQA[B][Q]利用Matlab拟合出模型参数分别为:
　　Vm=0.4563mmol/L/min KA=1.408×103mmol/L KB=0.5336
　　KQA=2.318×10-3 KBQA=2.038×10-2L/mmol KIQ=5.001×102mmol/L将该模型参数代入反应速度方程，计算出模型的相对误差为11.98％，拟合值和实验值能较好的吻合。
　　(2)乙酸香叶酯的制备及其动力学研究:对实验室现有的6种不同来源的游离脂肪酶进行筛选，得到1号脂肪酶为该反应的最佳实验用酶。确定该反应的优化反应条件为:以乙酸乙烯酯作为反应物兼溶剂;反应温度为30℃;摇床转速为240rpm;反应酶量为12mg/mL;优化反应条件下，反应3h产率可达99％左右。底物浓度在500mmol/L以下时，不存在底物抑制现象，同时也不存在产物抑制。该脂肪酶重复使用8次后，反应的产率仅剩原来的42％，这表明所用脂肪酶的稳定性也还有待提高。动力学研究表明该反应为一个无底物、无产物抑制的乒乓双-双反应机制，其反应速度方程如下:
　　V=Vm[B]/KA+KB[B]+ KQA[Q]+ KBQA[B][Q]拟合得到的模型参数分别为:
　　Vm=0.1154mmol/L/min KA=1.886×102mmol/L KB=0.7842
　　KQA=0.1335 KBQA=1.400×10-3L/mmol计算出模型的相对误差为1.88％，拟合值和实验值能较好的吻合。
　　(3)脂肪酶的固定化:以邻苯二胺作为单体制备聚邻苯二胺空心微球，利用五种不同的硅烷试剂对该聚合物表面进行修饰，并采用吸附法对1号脂肪酶进行固定化，考察固定化条件和固定化酶催化性能，结果显示:经硅烷改性的聚邻苯二胺能明显影响固定化酶的蛋白结合量以及酶活，其中N-辛基三甲氧基硅烷改性的载体用于固定化脂肪酶的效果最佳。对固定化工艺进行优化，最终确定吸附固定化脂肪酶的优化条件为:硅烷用量为8mL，酶与载体的比例为1/30，缓冲液为pH8.0，40mmol/L的磷酸缓冲液，吸附时间为5h，吸附温度为30℃，摇床转速为200rpm。该条件下制备的固定化脂肪酶的水解比活和转酯比活分别为游离酶的11.8和12.6倍。此外，经固定化后该脂肪酶的热稳定性和存储稳定性也均有了明显的提高。
　　(4)固定化脂肪酶在典型无环单萜类乙酸酯制备中的应用:将所制固定化脂肪酶分别用于催化合成乙酸香茅酯和乙酸香叶酯两个反应体系中，对反应工艺进行优化。最终确定两个反应的优化条件均为:固定化酶的用量为0.4g，反应温度为50℃，反应过程中摇床转速为200rpm;在此条件下，反应1.5h后乙酸香茅酯和乙酸香叶酯的产率均可达99％以上。对固定化脂肪酶重复利用性的研究表明:在乙酸香茅酯的制备反应体系中，第2次重复使用该固定化脂肪酶时，残余酶活仍为初始酶活的98％以上，而游离酶的残余酶活仅为原来的56％左右;在乙酸香叶酯的制备反应体系中，固定化脂肪酶重复使用8次后，残余酶活仍为初始酶活的90％左右，而游离酶的残余酶活已不足原来的一半。由此可见，该脂肪酶经固定化后反应稳定性得到了显著提高。

目录

摘要

1．文献综述

1．1 无环单萜类乙酸酯香料

1．1．1 萜类香料

1．1．2 无环单萜类乙酸酯香料及其用途

1．1．3 无环单萜类乙酸酯的制备方法

1．1．4 酶法合成典型无环单萜类乙酸酯的研究进展

1．2 脂肪酶及其在非水相催化中的应用

1．2．1 脂肪酶简介

1．2．2 脂肪酶的界面催化机理

1．2．3 影响非水相脂肪酶催化活性的主要因素

1．2．4 脂肪酶在非水相催化中的应用

1．3 酶的固定化

1．3．1 固定化的意义

1．3．2 固定化的方法

1．3．3 固定化对酶催化性能的影响

1．3．4 固定化的载体

1．4 本文的研究思路和主要内容

2．有机溶剂中游离脂肪酶催化转酯化反应合成乙酸香茅酯及其动力学的研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验用酶

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要实验仪器

2．2．4 实验方法

2．2．5 气相色谱分析方法

2．2．6 反应初速度的测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 脂肪酶的筛选

2．3．2 溶剂的筛选

2．3．3 酶量的影响

2．3．4 温度的影响

2．3．5 摇床转速的影响

2．3．6 水添加量的影响

2．3．7 底物浓度的影响

2．3．8 产物乙酸香茅酯的影响

2．3．9 酶的重复利用

2．3．10 无溶剂体系中脂肪酶催化转酯化反应合成乙酸香茅酯的反应机理

2．3．11 反应动力学模型的推导

2．3．12 反应动力学参数的拟合

2．4 本章小结

3．有机溶剂中游离脂肪酶催化转酯化反应合成乙酸香叶酯及其动力学的研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验用酶

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要实验仪器

3．2．4 实验方法

3．2．5 气相色谱分析

3．2．6 反应初速度的测定

3．3 结果与讨论

3．3．1 不同来源的脂肪酶的筛选

3．3．2 溶剂的选择

3．3．3 酶量的影响

3．3．4 温度的影响

3．3．5 摇床转速的影响

3．3．6 水添加量的影响

3．3．7 底物浓度的影响

3．3．8 产物乙酸香叶酯的影响

3．3．9 酶的重复利用

3．3．10 无溶剂体系中脂肪酶催化转酯化反应合成乙酸香香叶酯的反应动力学

3．4 本章小结

4．硅烷修饰的聚邻苯二胺空心微球作为载体吸附法固定化脂肪酶

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 实验材料及试剂

4．2．2 主要实验仪器

4．2．3 载体的制备

4．2．4 吸附法固定化脂肪酶

4．2．5 脂肪酶活力的测定

4．2．6 酶的热稳定性

4．2．7 酶的存储稳定性

4．2．8 分析方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 聚邻苯二胺的表征

4．3．2 载体的硅烷化修饰对固定化效果的影响

4．3．3 硅烷用量对固定化效果的影响

4．3．4 固定化条件对固定化酶活力的影响

4．3．5 固定化酶的热稳定性

4．3．6 固定化酶的存储稳定性

4．4 本章小结

5．固定化脂肪酶在典型无环单萜类乙酸酯香料合成中的应用

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 实验材料及试剂

5．2．2 主要实验仪器

5．2．3 实验方法

5．2．4 气相色谱分析

5．2．5 反应初速度的测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 固定化酶量的影响

5．3．2 温度的影响

5．3．3 摇床转速的影响

5．3．4 固定化酶的重复利用性

5．4 本章小结

6．结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明